면역 형광 및 신경 추적을 가진 쥐 두개골 듀라 마터의 칼시토닌 유전자 관련 펩타이드 면역 반응성 내적 내부 발산 시각화
Summary
여기서 우리는 CGRP 및 phalloidin을 이용한 면역형광 및 형광 히스토화학을 사용하여 두개골 듀라 메이트에서 칼시토닌 유전자 관련 펩티드(CGRP)-면역반응성 신경 섬유 및 혈관의 공간 상관관계를 시각화하는 프로토콜을 각각 제시한다. 또한, 이러한 신경 섬유의 기원은 형광 신경 추적자로 역행하였다.
Abstract
이 연구의 목적은 면역형광, 3차원(3D) 재구성 및 역행 추적 기술을 사용하여 두개골 dura mater의 칼시토닌 유전자 관련 펩타이드(CGRP)-면역 반응성 감각 신경 섬유의 분포 와 기원을 검사하는 것이었습니다. 여기서, 신경 섬유와 혈관은 CGRP와 형광 프할로이드를 이용한 면역형광 및 히스토케미크 기술을 각각 사용하여 염색하였다. dural CGRP-immuoreactive 신경 섬유및 혈관의 공간 상관 관계는 3D 재건에 의해 입증되었다. 한편, CGRP-면역반응성 신경 섬유의 기원은 두개골 성두막 마터에서 중간 수막 동맥(MMA) 주위 영역에서 플루오로골드(FG)를 가진 신경 추적 기술에 의해 검출되어 삼차 신경절(TG) 및 자궁 경부(C) 등류(DGS)에 의해 검출되었다. 또한, TG 및 DRGs에서 FG 표지 뉴런의 화학적 특성도 이중 면역 형광을 사용하여 CGRP와 함께 검사하였다. 투명한 전산 시료 및 3D 재구성을 활용하여 CGRP-면역반응성 신경섬유및 팔로이드인 라벨이 부착된 아질리올이 함께 실행되거나 별도로 3D 뷰에서 두루알 신경혈관 네트워크를 형성하는 것으로 나타났다. FG 표지된 뉴런은 TG의 안과, 상악, 및 하악 성 나뭇가지뿐만 아니라 C2-3 DRGs ipsilateral에서 발견되었지만, 일부 FG 표지 뉴런중 일부가 CGRP-면역 반응성 발현으로 제시되는 추적기 적용 의 측면에 있다. 이러한 접근법으로, 우리는 두개골 듀라 메이터의 혈관 주위CGRP 면역 반응성 신경 섬유의 분포 특성뿐만 아니라 TG와 DRGs에서 이러한 신경 섬유의 기원을 입증했다. 방법론의 관점에서, 생리학적 또는 병리학적 조건 하에서 두개골 두라 메이트의 복잡한 신경 혈관 구조를 이해하는 데 귀중한 참조를 제공 할 수 있습니다.
Introduction
두개골 두라 메이트는 뇌를 보호하기 위해 수막의 가장 바깥쪽 층이며 풍부한 혈관과 다양한 종류의 신경섬유1,2를함유하고 있다. 많은 연구는 민감 두개골 두라 mater 가 비정상적인 혈관 확장 및 내면3,4,5를포함하는 두통의 발생으로 이어지는 핵심 요인이 될 수 있음을 보여 주었다. 따라서, 두개골 두라 메이트에서 신경 혈관 구조의 지식은 두통의 병발생을 이해하는 데 중요하다, 특히 편두통에 대한.
두라 내분은 이전에 종래의 면역히스토케로 연구되었지만, 두개골 두라 메이트의 신경 섬유와 혈관의 공간 상관관계는6,7,8,9로덜 연구되었다. 둘레 신경혈관 구조를 보다 자세하게 밝히기 위해, 칼시토닌 유전자 관련 펩타이드(CGRP)와 프할로이드인은 면역형과 형광을 가진 전산 두개골 두라 메이트에서 각각 두루 신경 섬유와 혈관을 염색하기 위한 마커로선택되었다. 신경혈관 구조의 3차원(3D) 뷰를 얻기에 최적의 선택이 될 수 있다. 또한, 형광금(FG)은 CGRP-면역반응성 신경섬유의 기원을 결정하기 위해 두개골 듀라 메이트러의 중간 수막 동맥(MMA) 주변 부위에 적용되었고, 삼차 신경절(TG) 및 자궁경부(C)를 추적하여 FG-면역성 신경망을 함께 검사하였다.
이 연구의 목적은 CGRP 면역 반응성 이내및 그 기원을 위한 두개골 듀라 메이트의 신경혈관 구조를 조사하기 위한 효과적인 도구를 제공하는 것이었습니다. 투명한 전산 듀라 메이트를 활용하고 면역형광, 역행 추적, 공초점 기술 및 3D 재구성을 결합함으로써 두개골 듀라 메이트에서 신경혈관 구조에 대한 새로운 3D 뷰를 제시할 것으로 기대됩니다. 이러한 방법론적 접근법은 다른 두통의 병발생을 탐구하기 위해 더 많이 제공 될 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 연구에서는, 우리는 성공적으로 CGRP 항체 및 FG 신경 추적자를 사용하여 면역 형광, 3D 재건 및 신경 추적 접근 방식을 사용하여 두개골 dura mater에서 CGRP 면역 반응성 신경 섬유의 분포와 기원을 입증하여 조직학적 및 화학적 증거를 제공하여 두경 신경 혈관 네트워크를 더 잘 이해할 수 있습니다.
알려진 바와 같이, CGRP는 편두통4,17의</…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 중국의 국가 키 R&D 프로그램 프로젝트 (프로젝트 코드 2019YFC1709103; No. 2018YFC1707804) 및 중국 국립 자연 과학 재단 (프로젝트 코드 번호 81774211; No. 817744432; No. 81774432; No. 81774432; No. 81774432; No. 81774432; No. 81774432; No. 81774432; No. 81774432; No. 81774432; No. 81774432; No. 81774432; No. 817744432; No. 81774432; No. No. 81774432; No. 81774432; No. 81774432; No. 81774432; No. 81774432; No.
Materials
| Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen by Thermo Fisher Scientific | A21202 | Protect from light; RRID: AB_141607 |
| Brain stereotaxis instrument | Narishige | SR-50 | |
| CellSens Dimension | Olympus | Version 1.1 | Software of fluorescent microscope |
| Confocal imaging system | Olympus | FV1200 | |
| Fluorogold (FG) | Fluorochrome | 52-9400 | Protect from light |
| Fluorescent imaging system | Olympus | BX53 | |
| Freezing microtome | Thermo | Microm International GmbH | |
| Olympus FV10-ASW 4.2a | Olympus | Version 4.2 | Confocal image processing software system |
| Micro Drill | Saeyang Microtech | Marathon-N7 | |
| Mouse anti-CGRP | Abcam | ab81887 | RRID: AB_1658411 |
| Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Phalloidin 568 | Molecular Probes | A12380 | Protect from light |
| Photoshop and Illustration | Adobe | CS6 | Photo editing software |
| Rabbit anti- Fluorogold | Abcam | ab153 | RRID: AB_90738 |
| Sprague Dawley | National Institutes for Food and Drug Control | SCXK (JING) 2014-0013 | |
| Superfrost plus microscope slides | Thermo | #4951PLUS-001 | 25x75x1mm |
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