Visualisation de l’innervation immunoréactive du peptide lié au gène de la calcitonine du dura mater crânien de rat avec immunofluorescence et traçage neuronal
Summary
Ici nous présentons un protocole pour visualiser la corrélation spatiale du peptide gène-connexe de calcitonine (CGRP) – fibres nerveuses immunoreactive et vaisseaux sanguins dans le mater crânien de dura utilisant l’immunofluorescence et l’histochimie fluorescente avec CGRP et phalloidin, respectivement. En outre, l’origine de ces fibres nerveuses a été tracée rétrograde avec un traceur neural fluorescent.
Abstract
Le but de cette étude était d’examiner la distribution et l’origine du peptide gène-connexe de calcitonine (CGRP) – fibres nerveuses sensorielles immunoreactive du mater crânien de dura utilisant l’immunofluorescence, la reconstruction (3D) tridimensionnelle et la technique de tracé rétrograde. Ici, les fibres nerveuses et les vaisseaux sanguins ont été souillés utilisant l’immunofluorescence et les techniques histochimiques avec CGRP et le phalloïdine fluorescent, respectivement. La corrélation spatiale des fibres nerveuses CGRP-immuoreactive dural et des vaisseaux sanguins ont été démontrées par reconstruction 3D. Pendant ce temps, l’origine des fibres nerveuses CGRP-immunoreactive ont été détectées par technique neurale de traçage avec le fluorogold (FG) du secteur autour de l’artère méningitique moyenne (MMA) dans le mater crânien de dura au ganglion de trigeminal (TG) et aux ganglions dorsaux cervicaux (C) de racine (DRGs). En outre, les caractéristiques chimiques des neurones FG-marqués dans le TG et le DRGs ont été également examinées ainsi que CGRP utilisant de doubles immunofluorescences. Profitant de l’échantillon transparent de tout-montage et de la reconstruction 3D, on lui a montré que les fibres nerveuses CGRP-immunoreactive et les artérioles phalloidin-étiquetées fonctionnent ensemble ou formant séparément un réseau neurovascular dural dans une vue 3D, alors que les neurones FG-marqués étaient trouvés dans les branches ophtalmiques, maxillaires, et mandibulaires de TG, aussi bien que le C2-3 DRGs ipsilateral du côté de l’application de traceur dans laquelle certains des neurones FG-marqués ont présenté avec l’expression CGRP-immunoreactive. Avec ces approches, nous avons démontré les caractéristiques distributionnelles des fibres nerveuses CGRP-immunoreactive autour des vaisseaux sanguins dans le mater crânien de dura, aussi bien que l’origine de ces fibres nerveuses de TG et de DRGs. Du point de vue de la méthodologie, il peut fournir une référence valable pour comprendre la structure neurovascular compliquée du mater crânien de dura sous l’état physiologique ou pathologique.
Introduction
La dura mater crânienne est la couche la plus externe des méninges pour protéger le cerveau et contient des vaisseaux sanguins abondants et différents types de fibres nerveuses1,2. De nombreuses études ont montré que le dura mater crânien sensibilisé peut être le facteur clé conduisant à l’apparition de maux de tête, impliquant la vasodilatation et l’innervation anormales3,4,5. Ainsi, la connaissance de la structure neurovascular dans le mater crânien de dura est importante pour comprendre la pathogénie des maux de tête, particulièrement pour la migraine.
Bien que l’innervation de dura ait été précédemment étudiée avec l’immunohistochemistry conventionnel, la corrélation spatiale des fibres nerveuses et des vaisseaux sanguins dans le mater crânien de dura ont été moins étudiées6,7,8,9. Afin d’indiquer la structure neurovasculaire dural plus en détail, le peptide gène-connexe de calcitonine (CGRP) et la phalloïdine ont été choisis comme marqueurs pour souiller respectivement les fibres nerveuses dural et les vaisseaux sanguins dans le mater crânien de dura de tout-monter avec l’immunofluorescence et l’histochimie fluorescente10. Il peut s’agir d’un choix optimal pour obtenir une vue tridimensionnelle (3D) de la structure neurovasculaire. En plus, le fluorogold (FG) a été appliqué sur le secteur autour de l’artère méningitique moyenne (MMA) dans le mater crânien de dura pour déterminer l’origine des fibres nerveuses CGRP-immunoreactive, et tracé au ganglion de trigeminal (TG) et aux ganglions dorsaux cervicaux (C) de racine (DRGs), alors que les neurones FG-labeled étaient plus loin examinés ainsi que CGRP utilisant l’immunofluorescence.
Le but de cette étude était de fournir un outil efficace pour étudier la structure neurovascular dans le mater crânien de dura pour l’innervation CGRP-immunoreactive et son origine. En tirant parti du mater transparent de dura de tout-monter et en combinant l’immunofluorescence, le tracé rétrograde, les techniques confocale, et la reconstruction 3D, nous nous attendions à présenter une vue 3D originale de la structure neurovascular dans le mater crânien de dura. Ces approches méthodologiques peuvent être encore servies pour explorer la pathogénie de différents maux de tête.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans cette étude, nous avons avec succès démontré la distribution et l’origine des fibres nerveuses CGRP-immunoreactive dans le mater crânien de dura utilisant l’immunofluorescence, la reconstruction 3D et les approches neurales de traçage avec l’anticorps CGRP et le traceur neural FG, fournissant les preuves histologiques et chimiques pour mieux comprendre le réseau neurovascular dural.
Comme on le savait, cgrp joue un rôle essentiel dans la pathogénie de la migraine<sup class=…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette étude a été soutenue par le projet du National Key R&D Program of China (code de projet n° 2019YFC1709103; n° 2018YFC1707804) et de la National Natural Science Foundation of China (code de projet n° 81774211; n° 81774432; n° 81801561).
Materials
| Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen by Thermo Fisher Scientific | A21202 | Protect from light; RRID: AB_141607 |
| Brain stereotaxis instrument | Narishige | SR-50 | |
| CellSens Dimension | Olympus | Version 1.1 | Software of fluorescent microscope |
| Confocal imaging system | Olympus | FV1200 | |
| Fluorogold (FG) | Fluorochrome | 52-9400 | Protect from light |
| Fluorescent imaging system | Olympus | BX53 | |
| Freezing microtome | Thermo | Microm International GmbH | |
| Olympus FV10-ASW 4.2a | Olympus | Version 4.2 | Confocal image processing software system |
| Micro Drill | Saeyang Microtech | Marathon-N7 | |
| Mouse anti-CGRP | Abcam | ab81887 | RRID: AB_1658411 |
| Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Phalloidin 568 | Molecular Probes | A12380 | Protect from light |
| Photoshop and Illustration | Adobe | CS6 | Photo editing software |
| Rabbit anti- Fluorogold | Abcam | ab153 | RRID: AB_90738 |
| Sprague Dawley | National Institutes for Food and Drug Control | SCXK (JING) 2014-0013 | |
| Superfrost plus microscope slides | Thermo | #4951PLUS-001 | 25x75x1mm |
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