Визуализация кальцитонина Гена связанных пептид иммунореактивной иннервации Крыса Краниал Дура Матер с иммунофторесценции и нейронной трассировки

Черепная dura mater является внешним слоем опоясывания для защиты мозга и содержит обильные кровеносные сосуды и различные виды^{нервных волокон 1,2}. Многие исследования показали, что сенсибилизированные черепные dura mater может быть ключевым фактором, ведущим к возникновению головных болей, с участием ненормальной вазодилатации и иннервации^3,4,5. Таким образом, знание нервно-мышечной структуры в черепной dura mater имеет важное значение для понимания патогенеза головных болей, особенно при мигрени.

Хотя иннервация дуры ранее изучалась с помощью обычной иммуногистохимии, пространственная корреляция нервных волокон и кровеносных сосудов в черепной мозговой оболочке^{была менее изучена 6,7,8,9.} Для того, чтобы выявить dural нервно-сосудистой структуры более подробно, кальцитонин гена связанных пептид (CGRP) и фаллоидин были выбраны в качестве маркеров для соответственно окрашивания дюрал нервных волокон и кровеносных сосудов в цельно-монтажной черепной dura матер с иммунофлуоресценции и флуоресцентной^{гистохимии 10}. Это может быть оптимальным выбором для получения трехмерного (3D) взгляда на нервно-мышечную структуру. Кроме того, флюорогольд (FG) был применен на области вокруг средней менингеальной артерии (MMA) в черепной dura mater, чтобы определить происхождение CGRP-иммунореактивных нервных волокон, и прослеживается в тригеминальный ганглий (TG) и шейки матки (C) спинной корневой ганглии (DRG), в то время как FG-помечены нейроны были дополнительно изучены вместе с CGRP.

Целью данного исследования было обеспечить эффективный инструмент для исследования нервно-мышечной структуры в черепной dura mater для CGRP-иммунореактивной иннервации и ее происхождения. Воспользовавшись прозрачной цельно-монтировкой dura mater и сочетая иммунофлуоресценцию, ретроградное отслеживание, конфокальные методы и 3D-реконструкцию, мы ожидали представить новый 3D-вид нервно-мышечной структуры в черепной мозговой матер. Эти методологические подходы могут быть дополнительно служил для изучения патогенеза различных головных болей.

Это исследование было одобрено Комитетом по этике Института иглоукалывания и Moxibustion, Китайская академия китайских медицинских наук (справочный номер D2018-09-29-1). Все процедуры были проведены в соответствии с Руководством национальных институтов по охране здоровья и использованию лабораторных животных (Национальная академия прессы, Вашингтон, D.C., 1996). В этом исследовании были использованы 12 взрослых самцов крыс Спраг-± (вес 220 и 20 г). «Лицензионный номер SCXK (JING) 2017-0005» были предоставлены Национальными институтами по контролю за продуктами питания и наркотиками.

1. Внутреннее иннервация крысиной черепной dura mater

1. Перфузионы
   1. Интраперитонально вводить передозировки триброметанола раствор (250 мг/кг) к крысе, чтобы вызвать эвтаназию.
   2. Как только дыхание останавливается, транскардиально пронизывать с 100 мл 0,9% нормального солевого раствора следуют 250-300 мл 4% параформальдегида в 0,1 М фосфат буфера (PB, pH 7.4).
   3. После перфузии, удалить кожу головы и открыть череп, чтобы разоблачить dura матер и спинной стороне мозга. Затем вскрыть черепный dura mater вдоль ствола мозга к обонятельной лампы в цельно-монтаж шаблон (Рисунок 1). Выполните постфиксацию в 4% параформальдегиде в течение 2 ч, а затем криопротектор в 25% сахарозы в 0,1 М ПБ более чем на 24 ч при 4 градусах Цельсия.
2. Флуоресценция иммуногистохимия для маркировки CGRP и фаллоидин
   ПРИМЕЧАНИЕ: Сочетание флуоресцентного окрашивания CGRP и фаллоидин был применен, чтобы выявить пространственную корреляцию волокон дюрального нерва и кровеносных сосудов в крысиной черепной dura mater в все-монтаж картины.
   1. Промыть черепную матер дура в 0,1 М ПБ около 1 мин.
   2. Инкубировать dura mater в блокирующий раствор, содержащий 3% нормальной сыворотки осла и 0,5% Triton X-100 в 0,1 М ПБ в течение 30 мин.
   3. Передача dura mater в мышь анти-CGRP антитела (1:1000) в 0,1 М ПБ, содержащий 1% нормальной сыворотки осла и 0,5% Тритон X-100 ночь при 4^{КК 11}.
   4. Вымойте dura mater три раза в 0.1 M PB на следующий день.
   5. Инкубировать dura mater в смешанном растворе осла анти-мышь Alexa Fluor 488 вторичных антител (1:500) и фаллоидин 568 (1:1000) в 0,1 М ПБ, содержащих 1% нормальной сыворотки осла и 0,5% Triton X-100 для 1,5 ч при комнатной температуре (26 градусов по Цельсию).
   6. Вымойте dura mater три раза в 0,1 М ПБ.
   7. Обрезать края и установить его на слайды микроскопа (см. Таблицу материалов).
   8. Положите на крышки с 50% глицерина до наблюдения.
3. Наблюдение и запись
   1. Наблюдайте за флуоресцентными образцами под флуоресцентным микроскопом или системой конфокальных изображений.
   2. Возьмите изображения цельно-монтировать dura mater флуоресцентным микроскопом, оснащенным цифровой камерой (4x, NA: 0.13), и использовать время экспозиции 500 мс. Мозаика изображения dura mater была завершена с програмным обеспечением флуоресцентного микроскопа (см. Таблицу материалов).
   3. Сделайте снимки CGRP-иммунореактивных нервных волокон и фаллоидин-маркированы кровеносные сосуды в dura матер с помощью конфокального микроскопа. Возбуждение и выброс длин волн были 488 нм (зеленый) и 594 нм (красный). Конфокальный пинхол составляет 110 (20x) и 105 мкм (40x). Разрешение захвата изображения составляет 640 х 640 пикселей.
   4. Захват 20 изображений в 2 мкм кадры из каждого 40 мкм толщиной раздела и выполнять одну в фокусе интеграции изображения с конфокальной обработки изображений, связанных с программной системой для 3D-анализа следующим образом: Установить Start Focal Plane | Установить конец координационного самолета | Установите размер шага | Выберите глубину шаблона | Захват изображения | Серия no.
   5. Используйте программное обеспечение для редактирования фотографий, чтобы настроить яркость и контрастность изображений для оптимизации визуализации. Обратите внимание на то, чтобы не удалять данные из изображений.

2. Ретроградное исследование трассировки с FG

1. Хирургические процедуры
   1. Определите область координат, представляющих интерес в крысиной черепной dura mater.
   2. Приготовьте микро-шприц в 10 йл и проверьте его с жидким парафином.
   3. Анестезия крыс с триброметанол раствором (150 мг/кг) с помощью внутриперитонеальной инъекции. Проверьте глубину в анестезии из-за отсутствия реакции на щепотку нота.
   4. Бритье головы крысы с электрической бритвой.
   5. Положите тупые ушные батончики крысе и поместите его на стереотаксис устройства. Затем положите держатель рта и нанесите офтальмологическую мазь на глаза.
   6. Очистите хирургическое место кожи головы с помощью 10% йода повидоне, за которым следует 75% этанола.
   7. Сделайте разрез вдоль средней линии кожи головы.
   8. Тупо удалить периостея и мышечные ткани от черепа с помощью стерильных хлопка наконечником аппликаторов (Рисунок 1A).
   9. Просверлите небольшое отверстие (5-7 мм) с помощью заусенцев с круглым кончиком бита (#106) на левой теменной и височной кости выше ММА¹², и убедитесь, что черепный dura mater был сохранен нетронутым(рисунок 1B).
   10. Построить банк вокруг отверстия с зубным силикатным цементом, чтобы ограничить распространение трассировщика (Рисунок 1C).
   11. Добавьте 2 МКЛ 2% FG в отверстие вокруг ММА с микро-шприцем 10 йл(рисунок 1D).
   12. Обложка отверстие с небольшим куском гемостатической губкой.
   13. Положите кусок парафиновой пленки на отверстие и запечатать края костным воском, чтобы предотвратить утечку трассировщика и избежать загрязнения окружающих тканей.
   14. Шов раны стерильной нитью.
   15. Держите крыс в теплой области, пока они полностью выздоровели.
   16. Верните крыс обратно в свои клетки и добавить антибиотик и анальгетики в питьевую воду.
2. Перфузии и секции
   1. После 7 дней выживания, пронизыть этих крыс, как упоминалось выше в процедурах в разделе 1.1.
   2. Рассекают TG и C1-4 DRGs, затем после исправления и криопротезируют их, как упоминалось выше в разделе 1.1.3(рисунок 1F).
   3. Вырежьте TG и DRG толщиной 30 мкм на системе микротома криостата в сагиттальной направлении и установленные на стеклянных слайдах с силаном.
3. Двойные иммунофлюоресценции для маркировки FG- и CGRP в TG и DRG
   ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя FG-маркировка может быть непосредственно наблюдается с УФ-освещением под ртутной^{лампой без дополнительного окрашивания 13,14,15,16}, помеченные нейроны с FG были дополнительно изучены в TG и цервикальных DRGs с использованием двойных иммунофлюоресценций с FG и CGRP для выявления происхождения dural CGRP-иммунореактивных нервных волокон в TG и DRG.
   1. Объехать секции гистохимической ручкой.
   2. Инкубировать секции в течение 30 мин в блокирующий раствор, содержащий 3% нормальной сыворотки осла и 0,5% Triton X-100 в 0,1 М ПБ.
   3. Передача образцов в раствор кролика анти-фторголд (1:1000) и мыши анти-CGRP антитела (1:1000) в 0,1 М ПБ, содержащих 1% нормальной сыворотки осла и 0,5% Тритон X-100 ночь при 4 градусов по Цельсию.
   4. Вымойте секции три раза в 0,1 М ПБ на следующий день.
   5. Инкубировать в смешанном растворе осла анти-кролик Alexa Fluor 594 (1:500) и осла анти-мышь Alexa Fluor 488 (1:500) вторичные антитела в 0,1 М ПБ, содержащие 1% нормальной сыворотки осла и 0,5% Тритон X-100 для 1,5 ч при комнатной температуре.
   6. Вымойте и примените крышки к разделам в качестве процедур в шагах 1.2.6 и 1.2.8.
4. Наблюдение и запись
   1. Сделайте снимки нейронов с маркировкой FG в TG и DRG под ультрафиолетовым освещением с помощью флуоресцентного микроскопа, оснащенного цифровой камерой.
   2. Захват изображений FG- и CGRP помечены нейронов в TG и DRGs под флуоресцентным микроскопом оснащен цифровой камерой.
   3. Используйте программное обеспечение для редактирования, чтобы настроить яркость и контрастность изображений и добавить метки на изображениях.

Нейрососудистая структура черепной мозговой оболочки
После иммунофлуоресцентного и флуоресцентного гистохимического окрашивания CGRP и фаллоидином, CGRP-иммунореактивные нервные волокна и фаллоидин помеченные дуральные артериолы и соединительные ткани были четко продемонстрированы по всей цельно-монтирующей черепной dura mater в 3D-образной картине(рисунок 2C,D,E,F). Было показано, что как толстые, так и тонкие CGRP-иммунореактивные нервные волокна работают параллельно дуральным артериолам, вокруг сосудистой стенки, или между кровеносными сосудами(рисунок 2D,E,F). Принимая преимущества 3D реконструкции, морфология дуральных артериол и пространственная корреляция dural CGRP-иммунореактивных нервных волокон и артериол могут быть четко продемонстрированы с разных точек зрения.

Ретроградные нейроны в TG и DRG
Через семь дней после применения FG на области ММА в крысиной черепной dura mater(рисунок 3A), FG-маркированные нейроны были обнаружены в TG и цервикальных DRGs на ипсилатеральной стороне трассировщика применения, который был непосредственно замечен под ультрафиолетовым освещением флуоресцентной микроскопии(рисунок 3B,C). FG-маркированные нейроны были найдены во всех трех ветвях TG с более высокой концентрацией на офтальмологических (V1) и челюстно-максиллярных (V2) делениях, и с меньшим количеством на мандибулярном деление (V3) (Рисунок 3B). Между тем, некоторые из FG-маркированы нейроны были также замечены в C2-3 DRGs (Рисунок 3C).

Кроме того, двойные иммунофлуоресценции были также выполнены с ФГ и CGRP на участках TG и шейки матки DRGs. По диаметру CGRP-иммунореактивных нейронов в ТГ и ДРГ, большинство из них были в основном найдены в малых и средних диаметров сенсорных нейронов (<50 мкм). Некоторые из этих типов CGRP-иммунореактивных нейронов были также помечены с FG в TG и C2-3 DRGs, указывая, что CGRP-иммунореактивных нервных волокон в черепной dura матер возникла из этих субпопуляции сенсорных нейронов в ТГ и DRGs (Рисунок 4).

Рисунок 1: Фотографии основных экспериментальных взглядов в настоящем исследовании. ( A) разрез вдоль средней линии кожи головы. (B) отверстие над черепной dura mater, показывающее среднюю менингеарной артерии (MMA). (C)Небольшой банк вокруг отверстия кружил с зубным силикатным цементом для применения трассировщика на черепной dura mater. (D)Применение фторгольда (ФГ) в отверстие с микро-шприцем. (E)Прозрачная цельно-монтированная дура-матер. (F)Внешний вид тригеминального ганглиона (TG). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 2: Корреляция между кальцитонином гена связанных пептид (CGRP)-иммунореактивных нервных волокон и фаллоидин (Pha)-помеченные артериолы на цельно-монтируется черепно-мозговой матер. (A ) Прозрачный цельно-монтировать dura матер. (B)цельно-монтированная дура-матер была сплющена и установлена на слайде. (C) Распределение CGRP-иммунореактивных нервных волокон и фа помеченных кровеносных сосудов вдоль средней менингеальной артерии (MMA). (D,E) Увеличенные фотографии из тех же областей d и e в панели C. (F) Увеличенные и скорректированные изображения с панели E с рамой в 3D-шаблоне. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 3: Распределение фторгольда (FG) помечены нейронов в тригеминальной ганглиона (TG) и шейки матки (C) спинной корень ганглиона (DRG) под ультрафиолетовым освещением. ( ) Область дура матер с применением FG. (B)Распределение нейронов с маркировкой FG в офтальмологических (V1), челюстно-челюстных (V2) и мандибулярных (V3) ветвях TG. (C)Распределение нейронов с маркировкой FG, распределенных в C2 DRG. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 4: Представитель фотографии, показывающие помечены сенсорных нейронов в тригеминальных ганглионов (TG) и шейки спинного корня ганглия (DRG) с помощью двойных иммунофторесценций с флюороголд (FG) и кальцитонина гена связанных пептид (CGRP). (A,B) помечены нейронов с FG, CGRP, и как FG и CGRP были продемонстрированы в красном, зеленом и желтом, соответственно, в TG (A) и DRG (B). (A1-B1), (A2-B2): Панели A и B были отдельно показаны с FG-маркировкой (A1, B1) и CGRP-маркировкой (A2, B2). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

В этом исследовании мы успешно продемонстрировали распределение и происхождение CGRP-иммунореактивных нервных волокон в черепной дюра-матер с использованием иммунофторесценции, 3D реконструкции и нейронных подходов к отслеживанию с антителами CGRP и FG нейронным трассировщиком, обеспечивая гистологические и химические данные, чтобы лучше понять dural нейрокулярной сети.

Как известно, CGRP играет решающую роль в патогенеза мигрени^4,17. Было показано, что увеличение CGRP может привести к вазодилатации и нейрогенного воспаления, чтобы вызвать периферическую и центральную сенсибилизацию вдоль^{тригеминального пути 4,18}. CGRP-иммунореактивные нервные волокна принадлежат к немиелинированных пептидргических сенсорных аксонов, ответственных за транспортировку ноцицептивных^{сигналов 19}. В соответствии с предыдущими исследованиями, здесь, мы четко продемонстрировали распределение CGRP-иммунореактивных нервных волокон в черепно-мозговой матер и проследить их происхождение от малого и среднего диаметра сенсорных нейронов в TG и DRGs. Эти клеточные структуры могут быть источниками для синтеза и выпуска CGRP. С другой стороны, фаллоидин является специфическим зондом для нитевидного актина (F-актина), который в изобилии в гладких мышечных и эндотелиальных клеток. В качестве правильного кандидата фаллоидин использовался для маркировки сосудистых структур и^{соединительных тканей 10,20,21.} Наше недавнее исследование показало, что, в отличие от альфа-гладкой мышцы актина и CD31, фаллоидин является более надежным и чувствительным для окрашивания дуральных артериол, и является оптимальным для объединения с CGRP для демонстрации черепной нервно-мышечной сети в деталях, которая была опубликована eslewhere^10,21.

Метод отслеживания нервных путей является важным инструментом для исследования нервного происхождения и прекращения. В настоящем исследовании, FG был использован для ретроградной отслеживания происхождения CGRP-иммунореактивных нервных волокон в черепной dura mater. Так как черепная dura mater является тонкой мембраной, трассировщик не может быть удобно применен путем инъекции. Вместо этого, FG был непосредственно добавлен в регионе вокруг ММА в черепной dura mater в соответствии с методом, который^{был введен ранее 22,23}, но необходимо позаботиться, чтобы сохранить дура матер нетронутыми. Кроме того, были предприняты усилия по предотвращению утечки ФГ в соседние ткани. Поскольку FG-маркировка может быть непосредственно замечена под ультрафиолетовым^{освещением ртутной лампы 24,}при этом подходе мы проверили сайт применения ФГ; было установлено, что помимо нервного распространения, FG был ограничен в регионе кружил с зубным силикатным цементом без загрязнения окружающих тканей. Другим преимуществом является то, что FG-помеченные нейроны также могут быть окрашены в ожидаемый цвет с помощью иммунофлуоресценции с антителами FG, что делает его более удобным для использования вместе с другими биомаркерами^14,15,16. Благодаря этому исследованию, мы доказали, что FG не только подходит для ретроградной отслеживания dural иннервации, но и является надлежащим кандидатом в сочетании с CGRP для определения химических характеристик FG-помеченных нейронов.

Здесь следует отметить, что нынешние методы предпочтительно используются для молодых животных. На ранней стадии крысы, черепная dura mater является более прозрачным в стиле цельного монтажа. Эта функция делает его более удобным для визуализации нервно-мышечной структуры черепной dura матер в 3D-образный узор без дальнейшего прозрачного лечения.

Таким образом, настоящее исследование обеспечивает ценный подход к эффективному изучению иннервации черепно-мозговой оболочки от сенсорных нейронов в TG и цервикальных DRGs, особенно подтип малых и среднего диаметра сенсорных нейронов с CGRP-иммунореактивного выражения. С точки зрения методологии, он может предоставить ценную ссылку для дальнейшего изучения других видов нервных волокон в черепной dura mater, а также их происхождение.