In Vitro Cultuur Strategie voor Eicellen uit early antral follikel bij runderen

Tijdens de reproductieve levensduur, slechts een minimale fractie van de eicellen die aanwezig zijn in een eierstok volwassen, worden vrijgegeven in de eileiders bij de ovulatie, en zijn beschikbaar voor bevrucht en ontwikkelen tot een levensvatbare embryo¹. Aan de andere kant ondergaan de meeste eicellen in een eierstok atresie en worden ze nooit ovulated. In vitro embryoproductie (IVP) technologieën hebben geprobeerd de exploitatie van de eierstokreserve²,^3teverhogen . Tot nu toe hebben dergelijke technologieën toegestaan interventies van vruchtbaarheid behoud, selectie programma’s in vee, en het behoud van bedreigde soorten. Niettemin, de meeste protocollen gebruiken eicellen die in principe hebben voltooid de groeifase binnen de antral eierstok follikel, en dus worden aangeduid als volgroeide eicellen. Bij runderen, waar IVP-technologieën op grote schaal worden gebruikt, bereiken volgroeide eicellen een uiteindelijke diameter van ongeveer 120 μm en worden ze verzameld uit follikels met een diameter van 2 tot 8 mm (middelgrote antralzakjes)¹. Bij isolatie van de follikels worden dergelijke eicellen in vitro gerijpt en bevrucht. De zygotes worden vervolgens gekweekt tot de blastocyst fase en ofwel overgebracht naar een ontvanger of cryopreserved. Bij runderen, maar ook bij vele andere soorten, ondanks het potentieel van IVP, is het aantal in vitro geproduceerde embryo’s per koe de afgelopen 40 jaar niet grotendeels verbeterd. Dit is deels te wijten aan het beperkte aantal volgroeide eicellen die een eierstok bevolken op een bepaald moment dat kan worden opgehaald en onderworpen aan standaard IVP-technieken^4,5,6.

De eicellen ingesloten in vroege antral follikels, dat wil zeggen, die follikels die minder dan 2 mm in diameter, vertegenwoordigen een potentiële bron te worden gebruikt in de vruchtbaarheid behoud programma’s⁷ , als een eierstok bevat ruwweg 10 keer meer vroege antrale follikels dan medium antral⁸. Deze eicellen bevinden zich echter nog in de groeifase en hebben nog geen volgroeide fase⁹bereikt . Als zodanig zijn ze nog steeds transcriptie actief, produceren mRNAs die zullen worden opgeslagen voor latere ontwikkelingsstappen, en hebben nog niet ondergaan alle differentiatie proces dat nodig is om de eicellen te verlenen met de mogelijkheid van spontaan hervatten en het invullen van meiose Ik eenmaal geïsoleerd uit de folliculaire compartiment^10,11. Daarom kunnen ze niet rechtstreeks worden onderworpen aan standaard in vitro maturatie (IVM) protocollen, maar ze vereisen een extra periode van cultuur die hen in staat zou stellen om de groeifase te voltooien en goed te differentiëren.

De overgang van het groeiende naar het volgroeide stadium, dat bij runderen optreedt wanneer de follikel zich ontwikkelt van de vroege antraal naar de gemiddelde antrarale fase, is een van de kritieke stappen tijdens de ontwikkeling van de eicel. Bij runderen probeerden verschillende studies deze voorvallen samen te vatten in vitro^{2,12,13,14,15,16,17,18,19}. Tot op heden zijn er echter geen betrouwbare protocollen ontwikkeld en is slechts beperkt succes gemeld. Volgens eerdere studies²⁰, deze groeiende eicellen vormen een homogene populatie. Naast transcriptie actief, wordt hun chromatine verspreid in de kiersyscle (GV), in een configuratie die GV0^2,21heet . Omgekeerd is de populatie van volgroeide eicellen verkregen uit middelgrote antralzakjes heterogeener, een aandoening die wordt weerspiegeld door de verschillende graden van chromatineverdichting (GV1, GV2 en GV3) die kunnen worden waargenomen²⁰. Uit eerdere gegevens is gebleken dat GV2 en GV3-eicellen over het algemeen worden gekenmerkt door een betere kwaliteit en een hogere embryonale ontwikkelingscompetentie^{20,21,22,23,24}.

Uitgaande van de bovenstaande waarnemingen beschrijven we hier een 5-dagen lang kweeksysteem van eicellen (L-IVCO) dat de differentiatie van eicyten geïsoleerd als cumulus-eicellencomplexen (COC’s) van vroege mierenfollillen mogelijk maakt. Deze cultuurstrategie is geëvolueerd van 10 jaar lange studies uitgevoerd in ons lab en wortels zijn grond op de eerder ontwikkelde 24-48 uur in vitro eicelcultuur (IVCO)², voorverzadigingssystemen^23,25 en zink suppletie tijdens de eicelcultuur . Een combinatie van follikel stimulerend hormoon (FSH) en een fosfodiesterase-3 (PDE3) remmer, in staat om cumulus-eicelcommunicatie te verbeteren^2,voortijdige meiotische hervatting²te voorkomen en oocytengroei² te ondersteunen.