Все шаги в этом протоколе одобрены и соответствуют рекомендациям Комитета по уходу за животными и их использованию в Университете Вирджинии. ПРИМЕЧАНИЕ: Есть несколько важных элементов контроля, которые следует учитывать на последующих этапах анализа, которые обобщены в таблице 1 и должны быть рассмотрены до введения липосом. 1. Получение флуоресцентно меченных липосом, нагруженных ацетатом кальция и тезаглитазаром Комбинируйте DSPC (1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфохолин), холестерин, PEG-2000-DSPE и DiD. Для этого комбинируйте DSPC, холестерин и PEG-2000 DSPE в массовом соотношении 2:1:1. Добавьте липидный краситель DiD в концентрации 1 мг DiD на 1 мл липосом (молярное соотношение 46:1 DSPC:DiD).ПРИМЕЧАНИЕ: DiD является общепринятой аббревиатурой для 1,1′-диоктадецил-3,3,3′,3’тетраметилиндокарбоцианинового красителя. Поскольку он имеет два октадецильных «жировых хвоста» равной длины DSPC, используемого в этом составе, он должен в основном включаться в липидную мембрану. Липидные красители, такие как DiO, DiD и DiI, обычно используются для исследования липосом8 и считаются невзаимозаменяемыми18. Используйте сцинтилляционный флакон объемом 20 мл для эмульсии инвертированной фазы и препарата липосом. В этом флаконе смешайте эфир-хлороформный раствор липидов 2:1 с водным раствором ацетата кальция (Ca-ацетат, 1 М, рН 7,4). Соотношение между органической и водной фазой должно составлять 4:1, например, 4 мл органической фазы и 1 мл водной фазы. Эмульгировать эфир-хлороформный раствор липидов ультразвуком в течение 30 с при комнатной температуре. Управляйте ультразвуковым аппаратом на частоте 20 кГц и мощности 50% и используйте 1/2 дюйма. зонд.ПРИМЕЧАНИЕ: Держите наконечник зонда ультразвукового аппарата ближе ко дну флакона, чтобы избежать вспенивания. Не прикасайтесь к стеклу наконечником зонда во время обработки ультразвуком, оно может разбиться. Кроме того, хлороформ необходимо добавлять к эфиру в качестве сорастворителя: в присутствии холестерина эмульсия, состоящая только из эфира, быстро отделяется, что делает этот этап процедуры невозможным. Немедленно поместите флакон с гомогенизированной эмульсией вода в масле на роторный испаритель со специальным адаптером, манометром, манометром и клапаном регулятора давления. Испаритель должен быть подключен к вакуумной линии для удаления органических растворителей. Установите скорость вращения на 100 об/мин и вакуум на 0,5 атм и отпустите, если вспенивание эмульсии выглядит чрезмерным. После того, как гель образуется и исчезает, увеличьте вакуум до 0,9 атм.ПРИМЕЧАНИЕ: Во время удаления летучей органической фазы уровень вакуума следует регулировать постепенно, чтобы избежать быстрого вспенивания, так как это может привести к потере содержимого из флакона в корпус роторного испарителя. В конце концов, когда эфир и хлороформ частично испаряются, а объемное соотношение между водной и органической фазами растворителя близко к 1:1, образуется гель. Испарение должно продолжаться до тех пор, пока гель не исчезнет, а оставшаяся водная среда снова не станет полностью жидкой. Дополнительное смешивание может помочь ускорить удаление органических растворителей. Этого можно достичь, поместив политетрафторэтиленовую мешалку в испарительную колбу для усиления конвекции вязкого геля во время ротационного испарения. Отфильтруйте полученные липосомы с помощью поликарбонатных мембран с трековым травлением для достижения однородного распределения по размерам.Выполняйте фильтрацию, пропуская водную дисперсию липосом туда и обратно несколько раз через поликарбонатный фильтр с порами 200 нм в экструдере липосом, оснащенном двумя газонепроницаемыми шприцами.ПРИМЕЧАНИЕ: Предпочтительны шприцы меньшего размера (например, 0,5 мл), поскольку они обеспечивают создание достаточного давления для фильтрации. При высоком содержании холестерина в липосомальной мембране высокая температура не нужна, и процедуру можно проводить при комнатной температуре. Выполняется нечетное количество фильтраций (например, 21), так что полученный материал оказывается на противоположной стороне фильтра с самого начала, и при предварительной стерилизации можно собрать стерильный образец отфильтрованных липосом с поправкой по размеру. Размер получаемых липосом обычно близок к выбранному размеру пор фильтра. Два фильтра могут быть сложены друг на друга (вместо одного) для точной регулировки для уменьшения размера частиц. Проверка распределения по размерам с помощью динамического лазерного рассеяния света (DLS)3,4.Добавьте от 1 до 3 мл физиологического раствора в кювету диаметром 1 см с четырьмя прозрачными сторонами. К этому добавьте 10\u201220 мкл липосом и тщательно перемешайте. Поместите образец в прибор и выберите следующие параметры для измерения: вязкость растворителя, показатель преломления, показатель преломления липидов. Нажмите кнопку «Пуск ». Измерения будут длиться несколько минут и состоять из 100 и более прогонов. Удалите внешний Ca-ацетат с помощью обессоливающей спиновой колонны. К половине партии добавляют водный тезаглитазар в буфер HEPES 10 мМ (рН 7,4) и инкубируют при перемешивании при 37 °C в течение 1 ч. Используйте вторую половину партии в качестве безлекарственного контрольного липосомного состава.ПРИМЕЧАНИЕ: Перед использованием предварительно уравновесьте спиновую колонку обессоливания объемом 2 мл буфером HEPES 10 мМ с pH 7,4. Для этого поместите 1 мл буфера HEPES в колонку и отжимайте в центрифуге при 1000 x g в течение 2 мин. Удалите сквозной буфер и повторите это четыре раза. Удалите незахваченный тезаглитазар из липосом с помощью спиновой колонки объемом 2 мл и определите концентрацию захваченного лекарственного средства спектрофотометрически. Добавьте не более 0,5 мл образца липосом в слой геля сухой колонки и подождите, пока весь образец не попадет в гель. Центрифугу проводят точно в тех же условиях, что и ранее (1000 х г, 2 мин) и собирают образец липосом в проходной очищенный от мелкомолекулярных соединений соединение. Количественная оценка конечных характеристик частиц: размера и концентрации частиц с использованием DLS и дзета-потенциала с помощью комбинированной системы DLS-электрофоректического рассеяния света (ELS)3,4 в буфере HEPES 10 мМ с pH 7,4 и при 25 °C.Аналогично этапу 1.5.2, разбавляют дисперсию липосом в измерительном буфере (например, 10 мкл липосом на 1 мл буферного раствора) в U-образную кювету с помощью одноразового шприца Люера или пипетки с отрезанным наконечником. Убедитесь, что в букве «U» нет пузырьков, чтобы было бесперебойное решение для протекания электрического тока. Поместите кювету в устройство (обратите внимание на переднюю и заднюю части кюветы, чтобы электроды были правильно подключены к устройству). Закройте дверцу прибора; После этого происходит измерение (с многократными повторами) под контролем программного обеспечения наведения. 2. Подготовьте липосомы для введения in vivo В шкафу биобезопасности разбавьте липосомы в стерильном физиологическом растворе до соответствующей концентрации в конечном объеме 50 мкл для введения in vivo.ПРИМЕЧАНИЕ: В предыдущих исследованиях наш липосомальный препарат содержал 2 мг/мл тезаглитазара, что составляет около 4,89 мкмоль тезаглитазара/мл, и мы вводили липосомы в дозе 1 мкмоль препарата/кг. Для мыши весом 40 г мы бы довели 8,2 мкл липосом до конечного объема 50 мкл физиологического раствора. Используя DLS/ELS, количество липосом на единицу объема также должно быть количественно определено для препаратов липосом, нагруженных лекарственными средствами и транспортными средствами, чтобы гарантировать, что на грамм веса мыши вводится равное количество липосом-носителей по сравнению с липосомами, нагруженными лекарственными средствами. Загрузите раствор липосом в иглу 27 г в шкафу биобезопасности. Храните его при комнатной температуре, чтобы избежать попадания холодного раствора в мышь. 3. Вводите липосомы с помощью ретроорбитальной внутривенной инъекции. ПРИМЕЧАНИЕ: Также целесообразно проводить внутривенную инъекцию другими методами, такими как инъекции в хвостовую вену, если это предпочтительно. Хотя это не охвачено этим протоколом, доступны опубликованные протоколы, объясняющие этот метод19 . Настройте рабочее пространство для доставки липосом.Очистите верстак 70% этанолом. Обязательно выберите место, которое позволяет использовать систему изофлурановой анестезии. Включите грелку и положите на нее чистую подушечку или полотенце, чтобы мышь оставалась на чистой поверхности. Дайте достаточно времени, чтобы подушечка прогрелась, прежде чем начинать работу с мышами. Настройте анестезиологическую систему так, чтобы камера находилась рядом, а носовой конус находился на согревающей подушке.Убедитесь, что все остальные аспекты системы готовы (например, уровень изофлурана в испарителе достаточно высок, угольный фильтр взвешен, трубки подключены правильно). Соберите другие материалы, необходимые для этого раздела протокола: офтальмологический гель-смазку, местный анестетик для лечения после введения, стерильные марлевые прокладки. Успокойте мышь с помощью изофлурана в индукционной камере. Как только он перестанет реагировать на легкое нажатие ногой, быстро переместите мышь на рабочее место, сохраняя при этом седативный эффект через носовой конус.ПРИМЕЧАНИЕ: Животное должно поддерживаться на уровне от 1,5% до 2,5% изофлурана и оцениваться на предмет соответствующей глубины анестезии (из-за отсутствия реакции на защемление пальца ноги) перед продолжением процедуры. Сдвиньте мышь в сторону для введения липосом. Поскольку мышь не будет моргать во время анестезии, нанесите небольшое количество офтальмологической смазки на оба глаза, чтобы они оставались увлажненными в течение оставшейся части процедуры. Аккуратно надавите на кожу выше и ниже открытого глаза. Глаз должен приподниматься над плоскостью лица. Осторожно вставьте кончик иглы в медиальный кантус, убедившись, что игла находится ниже глаза и не касается его. После того, как игла вставлена под глаз, медленно вводите липосомы в ретроорбитальное пространство. После извлечения иглы может потребоваться закрыть веки на несколько секунд для достижения гемостаза.Если игла не введена достаточно далеко, раствор может появиться вокруг глаза. Немедленно прекратите инъекцию, если это видно, и переместите иглу. Нанесите местный анестетик, такой как пропаракаин, на глаза, чтобы предотвратить боль и дискомфорт после процедуры. Держите мышь на грелке и следите за ней, пока она не проснется, чтобы убедиться, что она здорова и поддерживает надлежащую температуру тела. Верните мышь в клетку и в ее обычную среду обитания до тех пор, пока не наступит интересующая точка.ПРИМЕЧАНИЕ: Это должно быть сделано в соответствии с местными рекомендациями IACUC. 4. Подготовьте материалы для забора тканей, обработки тканей и окрашивания проточной цитометрией. Приготовьте растворы для сбора, обработки и окрашивания (разделы 5\u20127): фосфатно-солевой раствор (PBS)-гепарин, буфер HEPES, 2 мг/мл коллагеназы I типа, буфер для лизиса AKC, буфер FACS, PBS, буфер для фиксации (таблица 2). Во время процедуры храните все растворы, кроме фиксирующего буфера, при температуре 4 °C или на льду. Подготовьте пробирки с буферами и другими материалами для заготовки и обработки тканей.Для крови каждой мыши добавьте 10 мкл 0,5 М ЭДТА в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 или 1,7 мл для сбора крови. ЭДТА предотвратит свертывание крови. Также необходим шприц объемом 1 мл с иглой 25 г и коническая трубка объемом 15 мл. Для селезенки соберите одну микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 или 1,7 мл с 1 мл буфера HEPES, шприц объемом 1 мл, две конические пробирки по 50 мл и два фильтра по 70 мкм на селезенку. Для каждого депо жировой ткани соберите полиэтиленовый флакон объемом 20 мл с 1,5 мл буфера HEPES для измельчения ткани, коническую трубку объемом 50 мл и фильтр 70 мкм для каждого типа жировой ткани на мышь. Подготовьте рабочее пространство для сбора урожая.Очистите пространство скамейки 70% этанолом. Подготовьте резиновый лоток для закрепления мыши во время сбора урожая, очистив его 70% этанолом и накрыв впитывающей салфеткой или бумажными полотенцами. Убедитесь, что для работы доступно не менее 5 контактов. Наполните шприц объемом 10 мл PBS-гепарином и закрепите на игле 25G для перфузии. Соберите инструменты и материалы, чтобы использовать их во время сбора урожая. Необходимы щипцы (две пары), ножницы, бумажные полотенца, безворсовые салфетки, микроцентрифужная пробирка (пробирки) с ЭДТА, микроцентрифужная пробирка (пробирки) с буфером HEPES и полиэтиленовый флакон (флаконы) с буфером HEPES. 5. Соберите ткани Усыпить мышь удушьем CO2 . Не проводите вывих шейки матки, так как это может помешать эффективному сбору крови и перфузии тканей на более поздних этапах. На убранной скамейке с достаточным рабочим пространством и освещением, чтобы хорошо видеть мышь, установите резиновый лоток для вскрытия, ведро со льдом для хранения образцов и пульверизатор с 70% этанолом. Распылите на мышь 70% этанола, чтобы уменьшить загрязнение и контролировать распространение волос. Положите мышь на спину на резиновый лоток и прижмите ее лапы, расставленные вдали от тела. Чтобы подготовиться к сбору крови, аккуратно сделайте надрез на коже по краю каудального конца грудной клетки мыши. Отрежьте небольшую прямую линию вверх по направлению к голове мыши (около 1 см), пока грудные мышцы не обнажаются.В месте начального разреза сделайте два небольших надреза перпендикулярно линии по направлению к голове. Затем аккуратно отрежьте грудную мышцу с одной стороны грудной клетки в открытой области. Это обеспечивает лучший доступ и визуализацию того, куда следует вставить иглу. Чтобы собрать кровь, вставьте иглу между третьим и четвертым ребрами с той стороны, где была удалена мышца. Поскольку сердце мыши находится в центре грудной полости, держите иглу как можно ближе к центральной линии грудной клетки. После введения осторожно потяните шприц вверх, чтобы начать сбор крови. После сбора переложите кровь в подготовленную микроцентрифужную пробирку с ЭДТА и храните на льду.ПРИМЕЧАНИЕ: Если объем составляет около 100 мкл и в шприц не попадает кровь, попробуйте повернуть шприц вправо или влево в случае, если отверстие иглы прижато к стенке сердца. Если это не помогает, медленно продвигайте иглу дальше в грудную полость или начинайте извлечение. Если в этот момент в шприце начинает скапливаться кровь, продолжайте медленно оттягивать шприц. Рассмотрите возможность вращения шприца и иглы для успешного извлечения. Наконец, если кровь не собирается, извлеките иглу, так как она могла пропустить сердце. Попробуйте снова вставить иглу и повторить вышеупомянутый процесс еще раз. Затем, чтобы перфузировать мышь, откройте грудную полость, чтобы получить доступ к сердцу.Для этого срежьте кожу вдоль конца грудной клетки вниз до бока мыши с каждой стороны. Затем используйте щипцы, чтобы удерживать грудину подальше от рабочей поверхности. Сделайте небольшой неглубокий разрез чуть ниже конца грудины, чтобы прорезать брюшную полость. Разрежьте вдоль перитонеальной оболочки по концу грудной клетки с каждой из сторон мыши. Это должно обнажить печень и желчный пузырь. Будьте осторожны, чтобы не порезать ни одну из этих тканей. Далее делают небольшой, неглубокий надрез в диафрагме, краниально к печени. Затем разрежьте диафрагму по краю грудной клетки, чтобы открыть грудную полость. Обязательно избегайте разрезания каких-либо органов в грудной полости. Сделайте два надреза вдоль грудной клетки по направлению к голове примерно в 2-3 мм от центральной линии мыши и длиной около 0,75 см.ПРИМЕЧАНИЕ: Если разрезать слишком высоко, артерии, расположенные в верхней части грудной клетки, будут перерезаны. Это будет мешать эффективности перфузии. Поднимите центральную часть грудной клетки, чтобы обнажить грудную полость. Отодвиньте жир или ткани, чтобы получить доступ к сердцу. Сделайте небольшой разрез в правом предсердии сердца мыши, чтобы создать отверстие, через которое можно вытолкнуть кровь. С помощью шприца PBS-гепарина объемом 10 мл введите иглу в левый желудочек сердца мыши. Осторожно начните проталкивать PBS в сердце как можно медленнее.ПРИМЕЧАНИЕ: Следует наблюдать кровь, выходящую из правого предсердия и заполняющую грудную полость. Обязательно держите сердце в его физиологическом положении, чтобы избежать ингибирования потока PBS-гепарина из сердца через аорту. После того, как все 10 мл PBS-гепарина были перфузированы через мышь, выбросьте шприц и иглу и удалите излишки крови и PBS-гепарина из грудной полости с помощью бумажных полотенец или безворсовых салфеток. Затем, чтобы начать извлечение тканей, срежьте кожу и перитонеальную оболочку по направлению к хвосту мыши, чтобы открыть брюшную полость. Сначала извлеките подушечку паховой жировой ткани с каждой стороны мыши.ПРИМЕЧАНИЕ: Внимательно прочтите этот процесс: обязательно извлеките паховый лимфатический узел из каждого депо, чтобы избежать искажения клеточного состава жировой ткани в результатах.Используя второй набор щипцов, удерживайте перитонеальную мембрану одним набором щипцов, а край кожи, наложенный над мембраной с этой стороны, другими щипцами. Осторожно оттяните кожу от перитонеальной мембраны, чтобы отделить эти слои друг от друга. Ищите депо паховой жировой ткани вдоль кожи. Прижмите внешний край кожи, чтобы получить лучший доступ к жировому депо. Перед извлечением найдите паховый лимфатический узел в центре жирового депо и удалите его с помощью щипцов и ножниц по мере необходимости.ПРИМЕЧАНИЕ: Если возможно, найдите три большие артерии, которые идут от внешних краев депо к центру. Лимфатический узел расположен вокруг того места, где встречаются эти артерии. После удаления лимфатического узла осторожно удерживайте щипцами ближайший к закрепленной точке конец жирового депо и начинайте делать небольшие надрезы на соединительной оболочке между жировой тканью и кожей. Поднимите жировую ткань от кожи, делая надрезы, чтобы обеспечить лучший доступ к мембране и обеспечить извлечение всего депо. Поместите жировое депо в подготовленный полиэтиленовый флакон с буфером HEPES на льду, чтобы сохранить жизнеспособность ткани в течение оставшейся части сбора урожая. Повторите этот процесс с другой стороны мыши, чтобы извлечь оба склада. Склады могут быть переварены и обработаны как вместе, так и по отдельности. Если каждый склад должен обрабатываться отдельно, необходимо подготовить больше труб. Далее извлекают жировые депо придатка яичка из каудального конца брюшной полости. Используя щипцы, осторожно вытяните первое жировое депо придатка яичка от дорсального конца мыши и найдите придаток яичка и семявыносящий проток, прикрепленные к этому депо.ПРИМЕЧАНИЕ: Существует два жировых депо придатка яичка: по одному, прикрепленному к каждому придатку яичка и семявыносящему протоку.Аккуратно разрежьте жировое депо и придаток яичка и семявыносящего протока, чтобы отделить жировую ткань от этих других тканей. Поместите жировое депо в полиэтиленовый флакон с буфером HEPES на льду, чтобы сохранить жизнеспособность ткани в течение оставшейся части сбора урожая. Наконец, извлеките селезенку, которая находится слева от желудка возле диафрагмы. С помощью щипцов аккуратно потяните желудок к центру брюшной полости, чтобы обнажить селезенку.Аккуратно возьмитесь за один конец селезенки и слегка оттяните его от живота. Разрежьте оболочку между селезенкой и прилегающей к ней тканью до тех пор, пока орган не отсоединится. Поместите селезенку в подготовленную микроцентрифужную пробирку с буфером HEPES и храните на льду. Перед обработкой тканей или сбором тканей от следующей мыши выбросьте тушу и все загрязненные бумажные полотенца или подушечки. Также протрите инструменты.ПРИМЕЧАНИЕ: Если мышей несколько, повторите эти шаги сбора для каждой мыши, прежде чем переходить к следующему этапу обработки. Если включена контрольная мышь / мыши, рассмотрите возможность сбора их перед мышами, обработанными липосомами, чтобы избежать загрязнения. 6. Обработайте ткани ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку жировая ткань имеет длительную инкубацию пищеварения, рекомендуется сначала начать с этого процесса и работать над обработкой крови и селезенки в период пищеварения. Сначала пропустите через мясорубку и переварите жировые ткани. Используя одну или две пары ножниц, измельчите жировую ткань в каждом полиэтиленовом флаконе до тех пор, пока ткань не превратится в мелкие кусочки размером менее 0,5 мм. Это позволяет более эффективно переваривать.После того, как ткани во всех флаконах измельчены, добавьте 1,5 мл буфера коллагеназы 2 мг / мл в каждый флакон. Поместите флаконы в встряхивающий инкубатор с температурой 37 °C и 150 об/мин. Инкубировать от 30 до 45 минут.ПРИМЕЧАНИЕ: Если жировые ткани особенно большие, рассмотрите возможность добавления еще от 0,5 мл до 1,5 мл буфера HEPES и равного объема буфера коллагеназы во флакон (ы), чтобы убедиться, что ткани полностью погружены и присутствует достаточное количество фермента. Конечная концентрация коллагеназы I типа при пищеварении должна составлять 1 мг / мл независимо от конечного объема раствора. Кроме того, если встряхивающий инкубатор недоступен, образцы можно поместить в водяную баню, нагретую до 37 °C. Осторожно встряхивайте образцы каждые 5 минут, чтобы перемешать и возобновить пищеварение. Проверьте образцы через 30 мин. Используйте пипетку объемом 1 мл, чтобы запипетить образец вверх и вниз. Если кусочки ткани все еще слишком велики для легкого пипетирования, верните образцы в инкубатор еще на 15 минут. После того, как образцы полностью переварятся, продолжайте пипетировать образец вверх и вниз еще 10 раз, чтобы убедиться, что была создана одноклеточная суспензия.ПРИМЕЧАНИЕ: (Необязательно) Проверьте образцы через 30 минут. Используйте пипетку объемом 1 мл для пипетки образца вверх и вниз. Если кусочки ткани все еще слишком велики для легкого пипетирования, верните образцы в инкубатор еще на 15 минут. Пипетируйте клеточную суспензию через фильтр 70 мкм в коническую трубку объемом 50 мл. Добавьте 5 мл буфера FACS в пустой флакон для разложения, чтобы вымыть флакон. Перенесите этот буфер для промывки через фильтр, чтобы добавить его к суспензии клетки. Храните образцы на льду, пока другие обрабатываются. После того, как все образцы отфильтрованы, отжарьте их при 400 x g, 4 ° C в течение 5 минут. Удалите надосадочную жидкость адипоцита с помощью аспирации, а затем осторожно удалите инфранатант между надосадочной жидкостью адипоцита и гранулой путем аспирации, чтобы оставить гранулу стромально-васкулярной фракции (SVF). Ресуспендируют эту гранулу в 1 мл буфера FACS и переносят в чистую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 или 1,7 мл. Аликвотные ячейки теперь при желании или необходимости. Держите на льду до тех пор, пока все образцы не будут готовы к окрашиванию проточной цитометрией.ПРИМЕЧАНИЕ: Если переваренные жировые депо были большими, рассмотрите возможность использования только 50% или 25% образца для проточного цитометрического окрашивания и анализа. Кроме того, если требуется какой-либо контроль флуоресценции минус один (FMO) или дополнительный контроль для анализа проточной цитометрии (таблица 1), обязательно аликвотируйте дополнительный образец в отдельную пробирку для обработки. FMO используются для различения отрицательного и положительного сигнала для отдельного флуорофроконъюгированного антитела в пределах полной панели, используемой в эксперименте. Во-вторых, обработайте кровь.Переведите 50 мкл крови в коническую пробирку объемом 15 мл. Добавьте 1 мл буфера для лизиса AKC в каждую пробирку и пипетите вверх и вниз, чтобы получить одноклеточную суспензию. Добавьте дополнительно 4 мл лизирующего буфера AKC в каждую пробирку и инкубируйте в течение 5-10 минут. Если имеется шейкер или ротатор, плотно закройте крышки трубок и поместите трубки на одну из них, чтобы улучшить перемешивание. Добавьте 5 мл буфера FACS, чтобы погасить процесс лизиса, и отжимайте образцы при 400 x g, 4 ° C в течение 5 мин. Удалите надосадочную жидкость и проверьте гранулы. Если он все еще довольно красный, повторите процесс лизиса. В противном случае ресуспендируют гранулы в 1 мл буфера FACS и переносят в чистую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 или 1,7 мл. Держите на льду до тех пор, пока все образцы не будут готовы к окрашиванию проточной цитометрией. Наконец, обработайте селезенку. Перенесите селезенку на фильтр 70 мкм через коническую трубку объемом 50 мл. Промойте ткань 1 мл буфера FACS, а затем разомните селезенку через фильтр с помощью плунжерного конца шприца объемом 1 мл. На протяжении всего процесса затирания промойте клетки в коническую пробирку объемом 50 мл, используя больше буфера FACS. Конечный объем в конической пробирке должен составлять 10 мл.Вращайте клетки при 300 x g при 4 ° C в течение 5 мин. Удалите надосадочную жидкость и ресуспендируйте в 1 мл буфера для лизиса AKC. Добавьте еще 4 мл буфера для лизиса AKC и инкубируйте в течение 5 минут. Добавьте 5 мл буфера FACS, чтобы погасить процесс лизиса, и отжимайте образцы при 300 x g при 4 ° C в течение 5 мин. Удалите надосадочную жидкость и ресуспендируйте гранулу в 1 мл буфера FACS. Перенесите суспензию через второй чистый фильтр 70 мкм в коническую трубку объемом 50 мл. Добавьте 4 мл буфера FACS, чтобы промыть исходную пробирку, и пропустите буфер через фильтр для получения конечного объема 5 мл. Перенесите 50 мкл клеточной суспензии в чистую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 или 1,7 мл и держите на льду до тех пор, пока все образцы не будут готовы к окрашиванию проточной цитометрией. Дополнительные аликвоты могут быть перенесены в пробирки, если требуется больше.ПРИМЕЧАНИЕ: Спленоциты являются отличными клетками для использования для одиночного окрашивания Live/Dead. Рассмотрите возможность переноса дополнительной аликвоты для этого элемента управления. 7. Окрашивание клеток из тканей для проточной цитометрии Отжим аликвотированных образцов при 400 x g, 4 °C в течение 5 мин. Удалите надосадочную жидкость и ресуспендируйте образцы в 50 мкл Fc-блока (разбавленного) (таблица 2). Инкубировать на льду 5 мин. Добавьте 50 мкл смеси 2x антител (таблица 3) к каждому образцу. Инкубировать на льду в темноте в течение 20 минут.ПРИМЕЧАНИЕ: Любые отдельные пятна НЕ должны окрашиваться этой смесью антител. Кроме того, если будут использоваться FMO, смеси антител FMO должны быть приготовлены отдельно. Промойте образцы 1 мл PBS и отжимайте при 400 x g, 4 ° C в течение 5 мин. Удалите надосадочную жидкость и ресуспендируйте образцы в 200 мкл жизнеспособного пятна (таблица 3). Инкубировать на льду в темноте в течение 20 минут.ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе не забудьте окрасить ячейки, которые были отложены для одиночного пятна «Живой/мертвый». Промойте образцы 1 мл буфера FACS и отжимайте при 400 x g, 4 °C в течение 5 мин. Удалите надосадочную жидкость и ресуспендируйте образцы (кроме живого/мертвого одиночного окрашивания) в 50 мкл фиксирующей среды (реагент А) для фиксации образцов. Инкубировать при комнатной температуре в темноте 15 мин.Ресуспендировать одинарное окрашивание Live/Dead в 100 мкл 2% PFA. Выдержать при комнатной температуре в темноте 5 мин. Промойте образец 1 мл буфера FACS и отжимайте при 800 x g, 4 °C в течение 5 мин. Удалите надосадочную жидкость и ресуспендируйте образцы в буфере FACS объемом от 250 до 500 мкл. Хранить при температуре 4 °C до тех пор, пока образцы не будут наведены на проточный цитометр. Промойте образцы 1 мл буфера FACS и отжимайте при 800 x g, 4 °C в течение 5 мин. Удалите надосадочную жидкость и ресуспендируйте образцы в 50 мкл среды для пермеабилизации (реагент B) плюс антитела к внутриклеточным белкам. Выдержать при комнатной температуре в темноте 20 мин. Промойте образцы 1 мл буфера FACS и отжимайте при 800 x g при 4 °C в течение 5 мин. Удалите надосадочную жидкость и ресуспендируйте образцы в 100 мкл 2% параформальдегида (ПФА). Выдержать при комнатной температуре в темноте 5 мин. Промойте образцы 1 мл буфера FACS и отжимайте при 800 x g, 4 °C в течение 5 мин. Удалите надосадочную жидкость и ресуспендируйте образцы в 250–500 мкл буфера FACS. Хранить при температуре 4 °C до тех пор, пока образцы не будут наведены на проточный цитометр.