이 프로토콜의 목표는 형광 표지된 리포솜을 합성하고 유세포 분석을 사용하여 세포 수준에서 리포솜의 생체 내 국소화를 식별하는 것입니다.
특히 표적 치료 접근법을 위해 생체 내에서 화합물을 전달하기 위해 리포솜을 사용하는 것에 대한 관심이 증가하고 있습니다. 리포솜 제형에 따라 리포솜은 신체의 다른 세포 유형에 의해 우선적으로 흡수될 수 있습니다. 이는 상이한 질환의 진행이 조직- 및 세포-유형-특이적이기 때문에 치료용 입자의 효능에 영향을 미칠 수 있다. 이 프로토콜에서는 DSPC, 콜레스테롤, PEG-2000 DSPE 및 지질 염료 DiD를 형광 표지로 사용하여 리포솜을 합성하고 형광 표지하는 한 가지 방법을 제시합니다. 이 프로토콜은 또한 생체 내에서 리포솜을 전달하고 유세포 분석을 사용하여 리포솜의 세포 특이적 흡수를 평가하기 위한 접근 방식을 제시합니다. 이 접근법은 리포솜을 흡수하는 세포 유형을 결정하고 세포 유형 및 조직 전반에 걸쳐 리포솜 흡수의 분포와 비율을 정량화하는 데 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜에는 언급되지 않았지만 세포계의 면역형광 및 단일 세포 형광 이미징과 같은 추가 분석은 세포내 염색을 평가할 수 있으므로 모든 결과 또는 결론을 강화할 것입니다. 프로토콜은 관심 조직에 따라 조정해야 할 수도 있습니다.
나노입자 약물 전달을 활용한 치료법 개발에 대한 관심이 높아짐에 따라 입자 분포 및 흡수를 준비하고 평가하는 방법은 계속해서 발전, 확장 및 연구 커뮤니티에서 접근할 수 있어야 합니다 1,2. 이 프로토콜은 과산화소체 증식제 활성화 수용체(PPAR)-α/γ 작용제인 테사글리타자르(tesaglitazar)가 로드된 DiD 표지 리포솜으로 처리한 후 생체 내에서 리포솜을 흡수한 정확한 세포 유형을 평가하기 위해 개발되었습니다 3,4. 이 연구에서 우리는 리포솜 테사글리타자르 치료에 의해 직접적인 영향을 받는 세포 유형, 표적 모이어티의 효능을 평가하고 관찰한 치료 결과를 설명하기 위한 가설을 생성할 수 있었습니다. 또한, 다양한 세포 유형에서 확립된 생물학적 기능은 대식세포, 수지상 세포 및 간 특이적 쿠퍼 세포와 같은 식세포가 리포솜의 대부분을 차지한다는 것을 시사합니다 5,6,7. 이 프로토콜을 활용하여 우리는 비고전적 식세포도 리포솜 3,4를 흡수할 수 있음을 입증했습니다.
이 프로토콜은 테사글리타자르를 가용화하고, 역상 증발에 의해 리포솜을 준비하고, 원격 약물 로딩을 위한 유인제로 칼슘 아세테이트를 사용하기 위한 최적화된 방법을 제시합니다. 제시된 방법은 많은 실험실에서 접근할 수 있으며 고온이 필요한 구하기 어려운 재료와 단계가 부족합니다. 이 프로토콜은 생체 내 순환 증가에 최적인 크기의 리포솜을 생산한다8. 또한, Su et al.에 의해 요약된 바와 같이, 현재까지 생체 내 리포솜 분포 및 조직 흡수를 평가하는 방법이 깊이9에서 연구되고 테스트되었습니다. 양전자 방출 단층 촬영 (PET), 자기 공명 영상 (MRI) 및 형광 분자 단층 촬영 (FMT) 방법을 사용하여 조직 특이 적 생체 분포 및 흡수를 정량화합니다 9,10,11. 이러한 방법은 생체 내 검출을 극대화하도록 최적화되었지만 세포 분해능에서 생체 내 리포솜 흡수를 정량화하는 능력은 여전히 부족합니다. 여기에 제시된 프로토콜은 유세포 분석을 사용하여 이러한 요구를 달성하는 것을 목표로 합니다. 마지막으로, 이 프로토콜의 경우 세포 흡수를 지방 조직을 포함한 몇 가지 조직으로 좁혔습니다. 비만, 신진 대사 장애 및 염증 12,13,14,15,16,17의 환경에서 치료법을 전달하기 위해 나노 입자를 사용할 가능성을 조사하는 문헌이 늘어나고 있습니다. 따라서 우리는 이러한 병리에서 중요한 역할을 하는 조직 중 하나인 지방 조직을 처리하고 분석하기 위한 효과적인 방법과 프로토콜을 공유하는 것이 중요하다고 느꼈습니다.
여기에서는 (i) 형광 지질 염료로 표지되고 항당뇨 화합물인 테사글리타자르가 로드된 리포솜을 준비하고, (ii) 역궤도 주사를 통해 마우스에 리포솜을 투여하고, (iii) 유세포 분석을 통해 세포 수준에서 리포솜 흡수를 감지하기 위해 조직을 수확, 처리 및 염색합니다. 이 프로토콜은 약 150μm 리포솜의 준비와 지방, 혈액 및 비장의 흡수 평가를 검토합니다. 리포솜 제제는 확장 가능하고 대부분 실온에서 수행되며 역상 증발을 활용하여 약물 로딩 및 유기 용매 제거를 극대화합니다. 이 프로토콜을 사용하면 정제된 리포솜 샘플에서 최대 2mg/mL 테사글리타자르 농도를 달성할 수 있습니다. 제조된 리포솜은 4°C의 HEPES 완충액에 1년 이상 보관할 수 있습니다. 우리의 경험에서, 그들은 평균 입자 크기의 최소한의 변화를 보여주었습니다. 10kDa 원심 필터를 사용하여 외부 약물로부터 리포솜을 한외여과 분리한 후 10% 미만의 약물 함량 손실이 분광광도계로 입증되었습니다.
리포솜을 준비하는 동안 고려해야 할 몇 가지 중요한 단계와 요소가 있습니다. 첫째, 프로토콜 단계의 순서가 중요하며 준수해야 합니다. 둘째, 테사글리타자르를 로딩할 때 사용되는 용액의 pH는 용해도와 효과적인 로딩을 최대화하기 위해 7.4로 유지되어야 합니다. 셋째, 장비와 필터의 적절한 조립은 각 단계의 출력이 적절한 크기와 순도를 갖도록 합니다. 예를 들어, 100nm 및 200nm 필터가 제대로 조립되지 않으면 더 이질적이고 부적절한 크기의 리포솜 배치가 발생할 수 있습니다. 넷째, 테사글리타자르가 리포솜으로 전달되는 것을 최대화하기 위해서는 약물 로딩 전에 Ca-아세테이트를 완전히 제거해야 합니다. Ca-아세테이트의 완전한 제거를 테스트하려면 고속 침전을 사용하여 리포솜을 제거한 다음 비리포솜 용액에서 Ca-아세테이트 수준을 측정합니다. 다섯째, 각 단계에서 리포솜 제제에 첨가되는 모든 물질의 질량을 측정하고 기록하는 것이 중요합니다. 이를 통해 적절한 농도를 계산할 수 있고 필요한 재료 비율을 유지할 수 있습니다. 마지막으로, 기술이 제대로 실행되지 않으면 바람직하지 않은 수준의 이질성이 있을 수 있습니다. DLS 및 전자 현미경과 같은 다른 접근 방식을 사용하여 이 매개변수를 철저히 확인하는 것이 중요합니다. 균질성을 향상시키려면 선택한 필터 크기를 조정하거나 두 개의 필터를 쌓는 것이 좋습니다.
또한 이 프로토콜을 완전히 수행하기 전에 유세포 분석을 위한 대조군 및 항체 패널을 계획하고 최적화하는 것이 중요합니다(표 1, 표 3). 항체는 염색에 적절한 농도가 사용되고 형광단 간의 겹침이 최소화되는지 확인하기 위해 테스트해야 합니다. 리포솜 준비 중에 사용되는 염료의 여기 및 방출도 패널 계획에 포함되어야 합니다. 우리의 결과에서, 우리는 Allophycocyanin (APC) 및 AlexaFluor 647과 같은 형광단과 유사한 여기 및 방출을 갖는 DiD를 활용했습니다. 따라서, 우리는 항체 패널에서 이러한 형광단에 접합된 항체를 선택하지 않았습니다. 또한 isotype 컨트롤은 이 프로토콜에 포함되지 않습니다. 이는 이 프로토콜을 위해 선택된 항체가 잘 검증되고 상업적으로 이용 가능한 항체이기 때문입니다. 그러나 이전에 최적화되지 않은 항체를 사용하는 데 관심이 있는 경우 전체 실험을 수행하기 전에 관심 조직의 이소타입 대조군에 대해 항체를 테스트하는 것을 고려하십시오.
이 프로토콜은 치료 후 마우스에서 혈액, 비장, 사타구니 지방 및 부고환 지방 조직을 추출하고 처리하는 방법을 보여주지만 이 일반적인 접근 방식은 다른 조직에 적용할 수 있습니다. 관심 조직에 따라 처리 및 소화 프로토콜을 변경해야 할 수도 있습니다: 폐21, 간22, 복강강 3, 골수3,23, 뇌 24.
고려해야 할 이 방법의 중요한 한계는 흡수가 동물당 한 시점에서만 평가될 수 있다는 것입니다. 따라서, 이 프로토콜을 다른 비침습적 이미징 기술과 결합하거나 평가를 수행하기 위한 충분한 자원을 보장하기 위해 그에 따라 계획하는 것이 유리할 수 있다. 리포솜은 처음 24시간 동안 몸 전체를 순환하며 리포솜을 흡수하는 세포의 수명 또는 흡수에 반응하는 방식에 따라 세포 사멸 또는 추가 식균 작용이 발생할 수 있습니다. 우리의 이전 연구는 다른 시점에서 DiD+ 인구의 인구 특성의 변화를 보여주었습니다3. 이러한 이유로 관심 메커니즘의 생물학과 가장 관련이 있는 초기 시점 또는 시점에서의 섭취를 평가하는 것이 중요합니다. 또한 이 프로토콜을 사용하여 전체 조직에서 세포 흡수의 정량화를 수행할 수 있지만 유세포 분석으로는 조직 국소화를 밝힐 수 없습니다. 이 접근법을 조직학적 방법과 결합하면 이러한 한계를 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다.
일반적으로 이 프로토콜은 조직학 및 전신 형광 이미징과 같은 기존 방법론을 보완합니다. 유세포 분석 도구 및 방법의 지속적인 발전으로 점점 더 구체적인 세포 집단에 대한 더 큰 패널의 개발이 가능해질 것입니다. 앞서 언급한 방법과 함께 이 프로토콜을 사용하면 세포 흡수 평가가 향상되고 유세포 분석으로 관찰된 결과를 검증할 수 있는 기회를 제공할 수 있습니다. 예를 들어, 지방 조직에 있는 대부분의 입자가 유세포 분석에 의해 대식세포에 흡수되었다는 것이 밝혀져야 합니다. 동일한 지방 조직의 추가 분취액의 면역형광은 세포 유형이 실제로 리포솜을 흡수하는지 확인하기 위해 대식세포 마커에 대해 저장, 고정, 절편 및 염색될 수 있습니다. 이 접근법은 세포 특이적 표적화 검증, 세포 흡수 정량화, 표적 이탈 흡수 식별, 관찰된 치료 결과에 대한 기계론적 가설을 생성하기 위한 정보 제공 등 수행된 나노입자 생체분포 분석에 엄격함을 더해야 합니다. 이 프로토콜은 또한 다른 리포솜을 사용하고, 다른 조직에서의 흡수를 조사하고, 비만 및 대사 장애 또는 나노 입자 전달이 실현 가능한 치료 옵션인 기타 질병 환경에서 새로운 화합물을 테스트하는 향후 연구에 적용할 수 있습니다.
The authors have nothing to disclose.
저자는 유세포 분석 교육 및 서비스를 제공한 Michael Solga와 나머지 Flow Cytometry Core 직원에게 감사를 표합니다. 저자는 또한 리포솜 준비(SSKD, DKB), 조직 수확(MAM, JCG), 유세포 분석 염색 및 샘플 수집(AU, PS, CM)에 도움을 준 Shiva Sai Krishna Dasa, Dustin K. Bauknight, Melissa A. Marshall, James C. Garmey, Chantel McSkimming, Aditi Upadhye 및 Prasad Srikakulapu에게 감사를 표합니다. 이 작업은 AstraZeneca, R01HL 136098, R01HL 141123 및 R01HL 148109, AHA 16PRE30770007 및 T32 HL007284 보조금의 지원을 받았습니다.
1-mL syringe | BD | 309659 | |
10-mL syringe | BD | 302995 | |
25-gauge needle, sterile for retro-orbital injection | BD | 305122 | |
27-gauge needle, sterile for retro-orbital injection | BD | 305620 | |
Anti-mouse B220 BV421 | Biolegend | 103251 | Clone RA3-6B2 |
Anti-mouse CD115 PE | eBioscience | 12-1152-82 | Clone AFS98 |
Anti-mouse CD11b PerCP Cy5.5 antibody | BD Biosciences | 550993 | Clone M1/70 |
Anti-mouse CD11c APC ef780 antibody | eBioscience | 47-0114-82 | Clone N418 |
Anti-mouse CD19 PE CF594 | BD Biosciences | 562291 | Clone 1D3 |
Anti-mouse CD3 FITC antibody | BD Biosciences | 553061 | Clone 145-2C11 |
Anti-mouse CD31 BV605 | Biolegend | 102427 | Clone 390 |
Anti-mouse CD45 PerCP | BD Biosciences | 557235 | Clone 30-F11 |
Anti-mouse F4/80 PE Cy7 | Biolegend | 123114 | Clone BM8 |
Bovine serum albumin | Gemini Bio-products | 700-107P | |
Desalting spin-column | ThermoFisher | 89889, 89890 | Zeba spin column |
DPBS | Gibco | 14190-144 | |
Dynamic Light Scattering, Nicomp 370 | Particle Sizing System, Inc | ||
FIX & PERM Cell Permeabilization Kit | ThermoFisher Scientific | GAS004 | |
Gauze sponges | Dermacea | 441211 | |
Heparin | Sigma | 3393-1MU | |
Liposome extruder | Millipore Sigma | Z373400 | LiposoFast |
Live/Dead Aqua | ThermoFisher Scientific | L34957 | |
Nanosight | Malvern Instruments Ltd | NS300 | |
Ophthalmic lubricant | Optixcare | 20g/70 oz Sterile | |
Paraformaldehyde, 16% w/v aq. soln., methanol free | Alfa Aesar | 433689L | |
Polyethylene vial for mincing | Wheaton | 986701 | |
Rotary evaporator | Buchi | Re111 | |
Sonicator | Misonix | XL2020 | |
T/Pump Heat therapy pump and pad | Gaymer Industries | TP-500 | |
Tesaglitazar | Tocris | 3965 | |
Track-etched polycarbonate membranes | Thomas Scientific | 1141Z** | Whatman, Nuclepore Polycarbonate hydrophilic membranes |
ZetaSizer/DLS-ELS system | Malvern Instruments Ltd |