פרוטוקול זה מציג גישה לטביעת אצבע ולחקור נתונים רב מימדיים שנאספו על ידי כרומטוגרפיית גז דו מימדית מקיפה יחד עם ספקטרומטריית מסה. אלגוריתמים ייעודיים לזיהוי תבניות (התאמת תבניות) מוחלים כדי לחקור את המידע הכימי המוצפן בשבר הנדיף של שמן זית כתית מעולה (כלומר, וולטילום).
עיבוד והערכת נתונים הם צעדים קריטיים של כרומטוגרפיית גז דו מימדית מקיפה (GCxGC), במיוחד כאשר הם מצמדים לספקטרומטריית מסה. המידע העשיר המוצפן בנתונים עשוי להיות בעל ערך רב אך קשה לגשת אליו ביעילות. צפיפות הנתונים ומורכבותם עלולים להוביל לזמנים ארוכים של פירוט ולדרוש הליכים מייגעים ותלויי אנליסטים. כלי עיבוד נתונים יעילים אך נגישים, אם כן, הם המפתח המאפשר התפשטות וקבלה של טכניקה רב ממדית מתקדמת זו במעבדות לשימוש יומיומי. פרוטוקול ניתוח הנתונים המוצג בעבודה זו משתמש בטביעות אצבע כרומטוגרפיות והתאמת תבניות כדי להשיג את המטרה של פירוק אוטומטי ביותר של כרומטוגרמות דו-ממדיות מורכבות לתכונות כימיות בודדות לזיהוי מתקדם של דפוסים אינפורמטיביים בתוך כרומטוגרמות בודדות ולאורך קבוצות של כרומטוגרמות. הפרוטוקול מספק עקביות ואמינות גבוהות עם התערבות מועטה. במקביל, פיקוח אנליסטים אפשרי במגוון הגדרות ופונקציות אילוץ שניתן להתאים אישית כדי לספק גמישות ויכולת להסתגל לצרכים ויעדים שונים. התאמת תבניות מוצגת כאן כגישה רבת עוצמה לחקור וולטילום שמן זית כתית מעולה. יישור צולב של פסגות מבוצע לא רק עבור מטרות ידועות, אלא גם עבור תרכובות untargeted, אשר מגדיל באופן משמעותי את כוח האפיון עבור מגוון רחב של יישומים. דוגמאות מוצגות כדי להדגים את הביצועים עבור סיווג והשוואה של דפוסים כרומטוגרפיים מקבוצות מדגם שנותחו בתנאים דומים.
כרומטוגרפיית גז דו מימדית מקיפה בשילוב עם זיהוי ספקטרומטרי מסה בזמן הטיסה (GC×GC-TOF MS) היא כיום הגישה האנליטית האינפורמטיבית ביותר לאפיון כימי של דגימות מורכבות1,2,3,4,5. ב- GC×GC, עמודות מחוברות באופן סדרתי ומתממשקות על-ידי אפנן (למשל, ממשק מיקוד תרמי או מבוסס שסתום) הלכוד רכיבים מרחפים מעמודת המימד הראשון(1D) לפני הזרקתן מחדש לעמודת המימד השני (2D). פעולה זו מתבצעת בתוך פרק זמן אפנון קבוע (PM), בדרך כלל נע בין 0.5-8 שניות. על ידי אפנון תרמי, התהליך כולל לכידת קריו והתמקדות של הלהקה eluting עם כמה יתרונות עבור כוח ההפרדה הכולל.
למרות ש- GC×GC היא טכניקת הפרדה דו-ממדית, התהליך מייצר ערכי נתונים רציפים. ממיר הגלאי אנלוגי לדיגיטלי (A/D) משיג את פלט האות הכרומטוגרפי בתדר מסוים. לאחר מכן, הנתונים מאוחסנים בתבניות קנייניות ספציפיות אשר לא רק מכיל את הנתונים הדיגיטליים אלא גם מטה-נתונים קשורים (מידע אודות הנתונים). ממיר A/D המועסקים במערכות GC×GC מסייע במיפוי עוצמת האות הכרומטוגרפי למספר דיגיטלי (DN) כפונקציה של זמן בשני הממדים האנליטיים. גלאים חד-ערוציים (למשל, גלאי יינון להבות (FID), גלאי לכידת אלקטרונים (ECD), גלאי כימילומינות גופרית (SCD) מייצרים ערכים בודדים לכל זמן דגימה, ואילו גלאים רב-ערוציים (למשל, גלאי ספקטרומטרי מסה (MS)) מייצרים ערכים מרובים (בדרך כלל, על פני טווח ספקטרלי) לכל זמן דגימה לאורך הריצה האנליטית.
כדי להציג נתונים דו-ממדייםבאופן חזותי, ההרחבה מתחילה ברסטר של ערכי נתונים בודדים של תקופת אפנון (או מחזור) כעמודת פיקסלים (רכיבי תמונה המתאימים לאירועי גלאי). לאורך זמן ההפרדה הדו-ממדית (ציר Y, מלמטה למעלה) מוצגת באופן חזותי זמן ההפרדה הדו-ממדי. עמודות פיקסל מעובדות ברצף כך שה-abscissa (ציר X, משמאל לימין) מדווח על זמן הפרדתצבע 1 D. הזמנה זו מציגה את הנתונים הדו-ממדיים במערכת קואורדינטות קרטזית ימנית, כאשר פקודתהשמירה הדו-ממדית היא האינדקס הראשון למערך.
עיבוד נתונים של כרומטוגרמות דו-ממדיותמעניק גישה לרמה גבוהה יותר של מידע מאשר נתונים גולמיים, ומאפשר זיהוי שיא דו-ממדי,זיהוי שיא, חילוץ נתוני תגובה לניתוח כמותי וניתוח חוצה השוואות.
ניתן להתייחס לדפוסי השיא הדו-ממדייםכאל טביעת האצבע הייחודית של הדגימה ולזהות תרכובות כתכונות minutiae לניתוח חוצה השוואתי יעיל. גישה זו, המכונה טביעת אצבע מבוססת תבנית6,7, נוצרה בהשראת טביעת אצבע ביומטרית6. מערכות אימות טביעות אצבע ביומטריות אוטומטיות, למעשה, מסתמכות על מאפיינים ייחודיים של קצות האצבעות: bifurcations רכס וסופים, מקומיים ומופקים מחשיפות בדיו או תמונות מפורטות. מאפיינים אלה, הנקראים תכונות minutiae, הם לאחר מכן מוצלבים עם תבניות מאוחסנות זמינות8,9.
כפי שהוזכר לעיל, כל דפוס הפרדת GC×GC מורכב מפסגות דו-ממדיותהמופצות באופן רציונלי על פני מישור דו-ממדי. כל פסגה תואמת לניתוח יחיד, בעלת הפוטנציאל האינפורמטיבי שלה, וניתן להתייחס אליה כאל תכונה אחת לניתוח דפוסים השוואתי.
כאן, אנו מציגים גישה יעילה עבור טביעת אצבע כימית על ידי GC×GC-TOF MS שמציעות יינון טנדם. המטרה היא לקטלג באופן מקיף וכמותי תכונות מתוך קבוצה של כרומטוגרמות.
בהשוואה לתוכנה מסחרית קיימת או לשגרה פנימית10,11 המשתמשים בגישה של תכונות שיא, טביעת אצבע מבוססת תבנית מאופיינת בספציפיות גבוהה, יעילות וזמן חישובי מוגבל. בנוסף, יש לו גמישות מהותית המאפשרת יישור צולב של תכונות minutia (כלומר, פסגות 2D) בין כרומטוגרמות לא מיושרות באופן חמור כמו אלה שנרכשו על ידי מכשור שונה או במחקרי מסגרת ארוכים12,13,14.
הפעולות הבסיסיות של השיטה המוצעת מתוארות בקצרה כדי להנחות את הקורא להבנה טובה של מורכבות התבנית הדו-ממדיתוכוח המידע. לאחר מכן, על ידי חקירת מטריצת נתוני פלט המכשיר, מתבצע זיהוי כימי וניתוחים ממוקדים ידועים הממוקמים מעל החלל הדו-ממדי. התבנית של פסגות ממוקדות נבנית ומוחלת על סדרה של כרומטוגרמות שנרכשו באותה אצווה אנליטית. מטה-נתונים הקשורים לשעות שמירה, חתימות ספקטרליות ותגובות (מוחלטות ויחסיות) מופקים מדפוסים מיושרים מחדש של פסגות ייעודיות ומאומצים כדי לחשוף הבדלים קומפוזיציוניים בערכת המדגם.
כשלב נוסף וייחודי של התהליך, מתבצעת גם טביעת אצבע משולבת לא ממוקדת וממוקדת (UT) על כרומטוגרמות ממוקדות מראש כדי להרחיב את פוטנציאל טביעת האצבע לניתוחים ידועים ולא ידועים כאחד. התהליך מייצר תבנית UT לניתוח השוואתי מקיף באמת שניתן להפוך לאוטומטי ברובו.
כצעד אחרון, השיטה מבצעת את היישור הצולב של תכונות בשני אותות גלאי מקבילים המיוצרים באנרגיות ייחון אלקטרונים גבוהות ונמוכות (70 ו-12 eV).
הפרוטוקול די גמיש בניתוחים תומכים של כרומטוגרמה אחת או קבוצה של כרומטוגרמות ועם כרומטוגרפיה משתנה ו /או גלאים מרובים. כאן, הפרוטוקול מוצג עם חבילת תוכנות GC×GC זמינה מסחרית (ראה טבלת חומרים)המשולבת לספריית MS ותוכנת חיפוש (ראה טבלת חומרים). חלק מהכלים הדרושים זמינים בתוכנות אחרות וכלים דומים יכולים להיות מיושמים באופן עצמאי מתיאורים בספרות על ידי רייכנבך ועמיתים לעבודה15,16,17,18,19. נתונים גולמיים להדגמה נגזרים ממחקר על שמן זית כתית מעולה (EVO) שנערך במעבדת המחברים14. בפרט, השבר הנדיף (כלומר, וולטילום) של שמני EVO איטלקיים נדגם על ידי מיקרו-אקסטרציה של פאזה מוצקה (HS-SPME) ומנותח על ידי GC×GC-TOF MS כדי ללכוד טביעות אצבעות אבחון לאיכות והסמכה חושית של דגימות. פרטים על דוגמאות, תנאי דגימה והגדרה אנליטית מסופקים בטבלת החומרים.
שלבים 1-6 מתארים עיבוד מקדים של הכרומטוגרמות. שלבים 7-9 מתארים עיבוד וניתוח של כרומטוגרמות בודדות. שלבים 10-12 מתארים יצירה והתאמה של תבניות, שהן הבסיס לניתוח בין מדגמים. שלבים 13-16 מתארים החלת הפרוטוקול על-פני קבוצה של כרומטוגרמות, עם שלבים 14-16 לניתוח UT.
הדמיה של נתוני MS ×GC-TOF היא צעד בסיסי להבנה נאותה של התוצאות שהושגו על ידי הפרדות דו-ממדיות מקיפות. עלילות תמונה עם צביעה מותאמת אישית מאפשרת לאנליסטים להעריך הבדלי תגובת גלאי ובכך את ההתפלגות הדיפרנציאלית של רכיבים לדוגמה. גישה חזותית זו משנה לחלוטין את נקודת המבט של האנליסטים על הפרשנות וההרחבה של כרומטוגרמות. צעד ראשון זה, לאחר שהובן ונ בשימוש בטוח על ידי כרומטוגרפים, פותח נקודת מבט חדשה בעיבוד נוסף.
היבט בסיסי נוסף של עיבוד נתונים הוא הנגישות למטריצת הנתונים המלאה (כלומר, נתונים ותגובות ספקטרליים של MS) עבור כל נקודות הדגימה, שכל אחת מהן תואמת לאירוע גלאי יחיד. במובן זה 2 D פסגות אינטגרציה, כךאוסף של אירועי גלאי המתאים ניתוח יחיד מייצגים צעד קריטי. בפרוטוקול הנוכחי, זיהוי פסגות דו-ממדיותמבוסס על אלגוריתם קו פרשת המים18 עם כמה התאמות הכלולות בשיפור רגישות הגילוי במקרה של תרכובות שיתוף-eluting חלקיות. כדי להפוך את התהליך הזה לספציפי יותר, יש לבצע דה-קונבולוציה, ולאמץ נהלים מתוחכמים יותר. הדבר אפשרי על-ידי ביצוע זיהוי שיא יון עבור נתוני MS; האלגוריתם מעבד את מערך הנתונים ומבודד את התגובה מניתוח יחיד המבוסס על פרופילים ספקטרליים19,31.
שלב חשוב אך קריטי של הפרוטוקול, ושל כל תהליך פרשנות נתונים GC×GC-MS, מתייחס לזיהוי אנליטים. הליך זה, המוצע בשלבים 8 ו -9, בהיעדר ניתוח מאשר עם סטנדרטים אותנטיים, חייב להתבצע בקפידה על ידי האנליסט. פעולות אוטומטיות זמינות בכל תוכנה מסחרית; הם כוללים הערכת דמיון לחתימה ספקטרלית של MS מול ספקטרום הייחוס שנאסף (כלומר, ספריות ספקטרליות) והערכת יחסי מאפיינים בין יונים מזהים/מכמתים. עם זאת, נדרשים קריטריונים מאשרים נוספים כדי להסיק זיהוי של isomers. הפרוטוקול מציע אימוץ מדדי שמירה ליניאריים כדי לתעדף את רשימת המועמדים; המגבלה כאן מתייחסת לזמינות של נתוני שמירה ולעקביות שלהם.
המאפיין העיקרי שהופך גישה זו לייחודית הוא התאמת תבנית12,13,15,29. התאמת תבניות מאפשרת זיהוי תבניות דו-ממדיבצורה יעילה, ספציפית ואינטואיטיבית מאוד. ניתן להגדיר אותו, במונחים של רגישות וספציפיות, על-ידי החלת ערכי סף ו/או פונקציות אילוץ מותאמים אישית בעוד האנליסט יכול לפקח על ההליך על-ידי אינטראקציה פעילה עם פרמטרי פונקציית שינוי צורה. הייחודיות של תהליך זה מסתמכת על האפשרות ליישר מידע פסגות ממוקדות ולא ממוקדות בין דגימות של אצווה אחידה, אלא גם בין דגימות שנרכשו באותם תנאים נומינליים למרות חוסר התאמה בינוני עד חמור. היתרונות של פעולה זו מתייחסים לאפשרות לשמר את כל זיהויי הניתוחים הממוקדים, שהיא משימה שגוזלת זמן רב עבור האנליסט, ואת כל המטה-נתונים שנשמרו עבור פסגות ממוקדות ולא ממוקדות מהפעלות פירוט קודמות.
התאמת תבניות היא גם יעילה מאוד במונחים של זמן חישובי; קבצי MS נתונים ברזולוציה נמוכה מורכבים מכ- 1-2 Gb של נתונים ארוזים בעוד שניתוחי MS ברזולוציה גבוהה עשויים להגיע ל- 10-15 Gb לכל הפעלה אנליטית יחידה. התאמת תבניות אינה מעבדת את מטריצת הנתונים המלאה בכל פעם, אך בתחילה, מבצעת יישור זמן שמירה בין כרומטוגרמות באמצעות פסגות תבנית לאחר מכן, מעבדת פסגות מועמדים בתוך חלון החיפוש עבור דמיון שלהם תואם עם הפניה בתבנית. במקרה של חוסר התאמה חמור, המצב המאתגר ביותר, טרנספורמציות פולינומיאליות מסדר שני גלובליות ביצעו ביצועים טובים יותר משיטות מקומיות תוך צמצום זמן חישובי13.
עבור טכניקת GC×GC להתפשט באופן נרחב מעבר לאקדמיה ומעבדות מחקר, כלי עיבוד נתונים צריכים להקל על פעולות בסיסיות לבדיקת הדמיה וכרומטוגרמות; זיהוי של אנליטים צריך להציע את האפשרות לאמץ אלגוריתמים ונהלים סטנדרטיים (למשל, אלגוריתם חיפוש NIST וכיול IT); וניתוח חוצה השוואתי צריך להיות אינטואיטיבי, יעיל ונתמך על ידי כלים אינטראקטיביים. הגישה המוצעת עונה על צרכים אלה תוך הצעת אפשרויות וכלים מתקדמים להתמודדות עם מצבים מורכבים כגון ניתוח אלוציה משותפת, כיול ניתוחים מרובים, ניתוח סוג קבוצה ויישור זיהוי מקבילי.
הספרות המוזכרת מכסה היטב תרחישים אפשריים רבים שבהם GC×GC, ובאופן כללי יותר, כרומטוגרפיה דו מימדית מקיפה, מציעים פתרונות ייחודיים ותוצאות אמינות שלא ניתן להשיג על ידי 1D-כרומטוגרפיה בניתוח ריצה אחת. 5,32,33 למרות GC×GC הוא הכלי החזק ביותר המגביר את יכולת ההפרדה ורגישות, תמיד יש מגבלות כוח ההפרדה, רגישות, ויכולות מערכתיות אחרות. ככל שהתקרבו לגבולות מערכתיים אלה, ניתוח הנתונים הופך בהדרגה לקשה יותר. לכן, המחקר והפיתוח חייבים להמשיך ולשפר את הכלים האנליטיים העומדים לרשותנו.
The authors have nothing to disclose.
המחקר נתמך על ידי פרוגטו אגר – פונדזיוני ברוט לכל לה רייסרקה אגרואלימנטרה. פרויקט ראשי תיבות כינור – הגבורה של מוצרי זית איטלקיים באמצעות כלים אנליטיים חדשניים (https://olivoeolio.progettoager.it/index.php/i-progetti-olio-e-olivo/violin-valorization-of-italian-olive-products-through-innovative-analytical-tools/violin-il-progetto). תוכנת GC Image זמינה עבור גירסת ניסיון ללא תשלום עבור קוראים המעוניינים להדגים ולבדוק את הפרוטוקול.
1D SolGel-Wax column (100% polyethylene glycol; 30 m × 0.25 mm dc × 0.25 μm df). Carrier gas helium at a constant nominal flow of 1.3 mL/min. | Trajan SGE Analytical Science, Ringwood, Australia | PN 054796 | Carrier gas helium at a constant nominal flow of 1.3 mL/min. Oven temperature programming set as follows: 40°C (2 min) to 240°C (10 min) at 3.5°C/min. |
2D OV1701 column (86% polydimethylsiloxane, 7% phenyl, 7% cyanopropyl; 1 m × 0.1 mm dc × 0.10 μm df) from . | Mega, Legnano, Milan, Italy | PN MEGA-1701 | |
Automated system for sample preparation: SPR Autosampler for GC | SepSolve-Analytical, Llantrisant, UK | ||
Extra Virgin Olive oils: Sicily and Tuscany, Italy | Project VIOLIN (Ager – Fondazioni in rete per la ricerca agroalimentare) | Samples (n=10) were collected during the production year 2018 within the "Violin" project sampling campaign. Oils were submitted to HS-SPME to sample volatiles according to a reference protocol validated in a previous study of Stilo et al.14 | |
Gas chromatograph: Model 7890B GC | Agilent Technologies Wilmington DE, USA | ||
GC Image GC×GC edition V 2.9 | GC Image LLC, Lincoln, Nebraska | https://www.gcimage.com/gcxgc/trial.html | |
Image processing software | GC Image LLC, Lincoln, Nebraska | https://www.gcimage.com/gcxgc/trial.html | |
Mass spectrometer: BenchTOF-Select | Markes International Llantrisant, UK | ||
Methyl-2-octynoate (CAS 111-12-6) | Merck-Millipore/Supelco | PN: 68982 | |
Modulator controller: Optimode v2.0 | SRA Intruments, Cernusco sul Naviglio, Milan, Italy | ||
Modulator: KT 2004 loop type | Zoex Corporation Houston, TX, USA | ||
MS library and search software: NIST Library V 2017, Software V 2.3 | National Institute of Standards and Technology (NIST), Gaithersburg MD | https://www.nist.gov/srd/nist-standard-reference-database-1a-v17 | |
n-alkanes C8-C40 for retention indexing | Merck-Millipore/Supelco | PN: 40147-U | |
n-hexane (CAS 110-54-3) gas chromatography MS SupraSolv | Merck-Millipore/Supelco | PN: 100795 | |
Solid Phase Microextraction fiber | Merck-Millipore/Supelco | PN 57914-U | |
α- /β-thujone (CAS 546-80-5) | Merck-Millipore/Sigma Aldrich | PN: 04314 |