Approccio genetico in avanti a cellule vive per identificare e isolare i mutanti dello sviluppo nella chlamydia trachomatis
Summary
Questo protocollo utilizza promotori-reporter fluorescenti, microscopia a cellule vive e estrazione di inclusione individuale in un approccio genetico diretto in avanti per identificare e isolare i mutanti dello sviluppo della Chlamydia trachomatis.
Abstract
Il patogeno batterico intracellulare Chlamydia trachomatis subisce un ciclo di sviluppo costituito da due forme di sviluppo morfologicamente discrete. Il corpo elementare non replicativo (EB) avvia l’infezione dell’host. Una volta all’interno, l’EB si differenzia nel corpo reticolato (RB). L’RB subisce quindi più cicli di replica, prima di differenziarsi di nuovo alla forma EB infettiva. Questo ciclo è essenziale per la sopravvivenza del clamidiale in quanto il mancato passaggio da un tipo di cellula all’altro impedisce l’invasione dell’host o la replica.
Le limitazioni nelle tecniche genetiche dovute alla natura intracellulare obbligata della clamidia hanno ostacolato l’identificazione dei meccanismi molecolari coinvolti nello sviluppo del tipo di cellula. Abbiamo progettato un nuovo sistema plasmid dual promoter-reporter che, in combinazione con la microscopia a cellule vive, consente la visualizzazione della commutazione del tipo di cellula in tempo reale. Per identificare i geni coinvolti nella regolazione dello sviluppo del tipo di cellula, il sistema promotore-reporter delle cellule vive è stato sfruttato per lo sviluppo di un approccio genetico in avanti combinando la mutagenesi chimica del ceppo dual reporter, l’imaging e il monitoraggio della clamidia con la cinetica dello sviluppo alterata, seguita dall’isolamento clonale dei mutanti. Questo flusso di lavoro genetico in avanti è uno strumento flessibile che può essere modificato per l’interrogatorio diretto in una vasta gamma di percorsi genetici.
Introduction
Chlamydia trachomatis (Ctr) è un patogeno intracellulare obbligato che progredisce attraverso un ciclo di sviluppo bifasico che è essenziale per la sua sopravvivenza e proliferazione1. Questo ciclo è costituito da due forme di sviluppo, il corpo elementare (EB) e il corpo reticolato (RB). L’EB è replica incompetente, ma media l’invasione cellulare attraverso l’endocitosi indottadall’effetto 2. Una volta nell’host, l’EB matura fino al RB replicativo. L’RB esegue più cicli di replica prima di ri convertirsi all’EB al fine di avviare successivi cicli di infezione.
La gamma limitata di strumenti genetici ha limitato la maggior parte della ricerca clamidiale a studi biochimici o all’uso di sistemi surrogati. Di conseguenza, la chiarimenta della regolazione genica e il controllo del ciclo di sviluppo è stato difficile3,4. Una delle sfide più importanti nel campo del clamidia è il monitoraggio temporale ad alta risoluzione del ciclo di sviluppo della clamidia e l’identificazione delle proteine coinvolte nella sua regolazione. L’espressione genica durante il ciclo di sviluppo chlamydiale è stata tradizionalmente eseguita da metodi distruttivi “end point”, tra cui RNAseq, qPCR e microscopia a cellule fisse5,6. Anche se questi metodi hanno fornito informazioni preziose, le tecniche impiegate sono laboriose e hanno bassa risoluzione temporale5,6.
Nell’ultimo decennio, la manipolazione genetica del Ctr è progredito con l’introduzione della trasformazione plasmide e dei metodi per la mutagenesi7,8,9. Per questo studio, è stato sviluppato un sistema basato su plasmide per monitorare lo sviluppo di clamidiali nelle inclusioni individuali in tempo reale nel corso di un’infezione. È stato creato un trasformatore clamidiale che esprimeva sia un promotrice-reporter specifico di tipo cella RB che EB. Il reporter specifico RB è stato costruito fondendo il promotore del primo gene RB euo a monte della proteina fluorescente Clover. EUO è un regolatore trascrizionale che reprime un sottoinsieme di geni associati alla ceconeEB 10. Il promotore di hctB, che codifica una proteina istone-simile coinvolta nella condensazione nucleoide EB, è stato clonato direttamente a monte di mKate2 (RFP) per creare il reporter specifico EB11. La spina dorsale per hctBprom-mKate2/euoprom-Clover era p2TK2SW27. I promotori di hctB ed euo sono stati amplificati dal DNA genomico Ctr-L2. Ogni sequenza di promotore consisteva di 100 coppie di basi a monte del sito di inizio della trascrizione previsto per il gene clamidiale specificato più i primi 30 nucleotidi (10 aminoacidi) del rispettivo ORF. Le varianti di FP fluorescenti sono state ottenute commercialmente come blocchi genivi ottimizzati per il codon Ctr e clonate nel telaio con i primi 30 nucleotidi di ogni gene e promotore clamidiale. Il terminatore incD è stato clonato direttamente a valle di mKate2. Il secondo promotore-reporter è stato inserito a valle del terminatore incD. Il gene di resistenza all’ampicillina (bla) in p2TK2SW2 è stato sostituito con il gene aadA (resistenza alla spectinomicina) da pBam4. Ciò ha portato al costrutto finale p2TK2-hctBprom-mKate2/euoprom-Clover (Figura 1A) che è stato trasformato in Ctr-L27. Questo ceppo di reporter RB/EB ha permesso l’osservazione del ciclo di sviluppo all’interno di singole inclusioni utilizzando la microscopia a cellule vive (Figura 1B,C).
Impiegando il nostro costrutto promotore-reporter in combinazione con la mutagenesi chimica, è stato ideato un protocollo per tracciare e isolare singoli cloni che mostravano anomalie dello sviluppo da popolazioni mutagenate di Ctr sierovar L2. Questo protocollo consente il monitoraggio diretto delle singole inclusioni clamidiali, il monitoraggio dei profili di espressione genica nel tempo, l’identificazione dei cloni clamidiali che esprimono un modello di espressione genica dello sviluppo alterata e l’isolamento clonale della clamidia dalle singole inclusioni.
Anche se questo protocollo è stato creato appositamente per l’identificazione dei geni coinvolti nello sviluppo del clamidiale, potrebbe essere facilmente adattato per interrogare qualsiasi numero di vie genetiche clamidiali.
Protocol
Representative Results
Discussion
La dissezione dei meccanismi che controllano il ciclo dello sviluppo della clamidia è stata ostacolata dalle limitazioni degli strumenti genetici attualmente disponibili. Impiegando il nostro promotore-reporter Chlamydia in combinazione con la microscopia automatizzata a cellule vive, è stato costruito un sistema che consente il monitoraggio dello sviluppo del tipo di cellula nelle singole inclusioni in un periodo di 24 ore. Questo sistema, in combinazione con la mutagenesi chimica e l’isolamento diretto dell’…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo il Dr. Anders Omsland della Washington State University per aver fornito i media assonali CIP-1. Questo lavoro è stato sostenuto dalla sovvenzione NIH R01AI130072, R21AI135691 e R21AI113617. Ulteriore supporto è stato fornito dai fondi di avvio dell’Università dell’Idaho e del Center for Modeling Complex Interactions attraverso la loro sovvenzione NIH P20GM104420.
Materials
| 24-well polystyrene plates | Corning | 3524 | Cell culture growth for reinfection of isolates |
| 6-well glass bottom plates | Cellvis | P06-1.5H-N | Cell culture growth for imaging |
| 96-well glass bottom plates | Nunc | 165305 | Cell culture growth for imaging |
| Bold line CO2 Unit | OKO Labs | CO2 UNIT BL | Stage incubator CO2 control |
| Bold line T Unit | OKO Labs | H301-T-UNIT-BL-PLUS | Stage incubator temperature control |
| Borosilicate glass capillary tubes | Sutter Instrument | B1005010 | Capillary tubes |
| BrightLine bandpass emissions filter (514/30nm) | Semrock | FF01-514/30-25 | Fluoescent filter cube |
| BrightLine bandpass emissions filter (641/75nm) | Semrock | FF02-641/75-25 | Fluoescent filter cube |
| CellTram Vario | Eppendorf | 5196000030 | Microinjector |
| Chlamydia trachmatis serovar L2 | ATCC | VR-577 | Chlamydia trachomatis |
| CIP-1 media | In house | NA | Axenic media. IPB supplemented with 1% FBS, 25 μM amino acids, 0.5 mM G6P, 1.0 mM ATP, 0.5 mM DTT, and 50 μM GTP, UTP, and CTP. (Omsland, A. 2012) made in-house. |
| Cos-7 cells (ATCC) | ATCC | CRL-1651 | African green monkey kidney cell (host cells) |
| Cycloheximide | MP Biomedicals | 194527 | Host cell growth inhibitor |
| Ethyl methanesulfonate, 99% | Acros Organics | AC205260100 | Mutagen |
| Fetal Plex | Gemini Bio-Products | 100-602 | Supplement for base growth media |
| Fiji/ImageJ | https://imagej.net/Fiji | NA | Open sourse Image analysis software. https://imagej.net/Fiji |
| Galaxy 170 S CO2 incubator | Eppendorf | CO1700100X | Cell culture incubation |
| gblocks (Fluorescent FP variants: Clover and mKate2) | Integrated DNA Technologies | NA | gblock ORFs of Ctr optimized FP varients for cloning into p2TK2SW2 |
| Gentamycin 10mg/ml | Gibco | 15710-064 | Antibiotic for growth media |
| HBSS (Hank's Balanced Salt Solution) | Corning | 21-020-CM | Host cells rinse |
| Heparin sodium | Amersham Life Science | 16920 | inhibits and reverses the early electrostatic interactions between the host cell and EBs |
| HEPES 1M | GE Life Sciences | SH30237.01 | pH buffer for growth media |
| InjectMan | Eppendorf | 5179 000.018 | Micromanipulator |
| Jupyter Notebook | https://jupyter.org/ | NA | Visualization of inclusion traces. https://jupyter.org/ |
| Lambda 10-3 | Sutter Instrument | LB10-3 | Filter wheel controler |
| Oko Touch | OKO Labs | Oko Touch | Interface to control the Bold line T and CO2 Unit |
| Prior XY stage | Prior | H107 | Motorized XY microscope stage |
| PrismR Centrifuge | Labnet | C2500-R | Temperature controlled microcentrifuge |
| Problot Hybridization oven | Labnet | H1200A | Rocking Incubator for infection with Chlamydia |
| Proscan II | Prior | H30V4 | XYZ microscope stage controler |
| Purifier Class 2 Biosafety Cabinet | Labconco | 362804 | Cell culture work |
| RPMI-1640 (no phenol red) | Gibco | 11835-030 | Base growth media for imaging |
| RPMI-1640 (phenol red) | GE Life Sciences | SH30027.01 | Base growth media |
| scopeLED excitation LEDs (470nm,595nm) | scopeLED | F140 | Excitation light |
| Sonic Dismembrator Model 500 | Fisher Scientific | 15-338-550 | Sonicator, resuspending chlamydial pellet |
| Stage incubator | OKO Labs | H301-K-FRAME | Cluster well plate incubation chamber |
| sucrose-phosphate-glutamate buffer 1X (SPG) | In house | NA | Chlamydial storage buffer. (10 mM sodium phosphate [8 mM K 2HPO 4, 2 mM KH 2PO 4], 220 mM sucrose, 0.50 mM L-glutamic acid; pH 7.4) |
| T-75 Flasks | Thermo Scientific | 156499 | Cell culture growth |
| TE 300 inverted microscope | Nikon | 16724 | microscope |
| THOR LED | Thor Labs | LEDD1B | White light |
| Trypsin | Corning | 25-052-CI | Dislodges host cells from flask for seeding into plates |
| Zyla sCMOS | Andor | ZYLA-5.5-USB3 | imaging camera |
| µManager 2.0gamma | https://github.com/micro-manager/micro-manager | NA | Open sourse automated microscope control software package |
Referencias
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