Live-Cell Forward Genetic Approach to Identify and Isolate Developmental Mutants in Chlamydia trachomatis
Summary
Dieses Protokoll verwendet fluoreszierende Promotor-Reporter, Live-Zell-Mikroskopie und individuelle Inklusionsextraktion in einem gerichteten vorwärts genetischen Ansatz, um Entwicklungsmutanten von Chlamydia trachomatiszu identifizieren und zu isolieren.
Abstract
Der intrazelluläre bakterielle Erreger Chlamydia trachomatis durchläuft einen Entwicklungszyklus, der aus zwei morphologisch diskreten Entwicklungsformen besteht. Der nicht-reproduzierende Elementarkörper (EB) initiiert eine Infektion des Wirts. Einmal im Inneren, unterscheidet sich der EB in den Retikulatkörper (RB). Die RB durchläuft dann mehrere Replikationsrunden, bevor sie sich wieder auf die infektiöse EB-Form unterscheidet. Dieser Zyklus ist für das Überleben der Chlamydien von entscheidender Bedeutung, da das Nichtumschalten des Wechsels zwischen Zelltypen eine Hostinvasion oder Replikation verhindert.
Einschränkungen in genetischen Techniken aufgrund der obligaten intrazellulären Natur von Chlamydien haben die Identifizierung der molekularen Mechanismen behindert, die an der Zelltypentwicklung beteiligt sind. Wir haben ein neuartiges Dual-Promoter-Reporter-Plasmidsystem entwickelt, das in Verbindung mit der Live-Zellmikroskopie die Visualisierung des Zelltypwechsels in Echtzeit ermöglicht. Um Gene zu identifizieren, die an der Regulierung der Zelltypentwicklung beteiligt sind, wurde das Live-Zell-Promotor-Reporter-System für die Entwicklung eines vorwärtsgenetischen Ansatzes genutzt, indem chemische Mutagenese des Dual-Reporter-Stamms, Bildgebung und Verfolgung von Chlamydien mit veränderter Entwicklungskinetik kombiniert wurden, gefolgt von klonaler Isolierung von Mutanten. Dieser vorwärtsgenetische Workflow ist ein flexibles Werkzeug, das für gezielte Verhöre in eine Vielzahl von genetischen Pfaden modifiziert werden kann.
Introduction
Chlamydia trachomatis (Ctr) ist ein obligate intrazellulärer Erreger, der durch einen biphasischen Entwicklungszyklus fortschreitet, der für sein Überleben und seine Proliferation wesentlich ist1. Dieser Zyklus besteht aus zwei Entwicklungsformen, dem Elementarkörper (EB) und dem Retikulatkörper (RB). Die EB ist Replikation inkompetent, aber vermittelt Zellinvasion durch Effektor induzierte Endozytose2. Einmal im Host, reift der EB zum replizierenden RB. Die RB führt mehrere Replikationsrunden durch, bevor sie wieder in die EB konvertiert, um nachfolgende Infektionsrunden zu initiieren.
Die begrenzte Palette genetischer Werkzeuge hat den größten Teil der Chlamydienforschung auf biochemische Studien oder den Einsatz von Ersatzsystemen beschränkt. Infolgedessen war die Aufklärung der Genregulation und die Kontrolle des Entwicklungszyklus schwierig3,4. Eine der wichtigeren Herausforderungen im Chlamydienfeld ist die hochauflösende zeitliche Verfolgung des Chlamydien-Entwicklungszyklus und die Identifizierung der Proteine, die an seiner Regulierung beteiligt sind. Die Genexpression während des Chlamydien-Entwicklungszyklus wurde traditionell mit destruktiven “Endpunkt”-Methoden wie RNAseq, qPCR und fester Zellmikroskopie5,6durchgeführt. Obwohl diese Methoden unschätzbare Informationen geliefert haben, sind die angewandten Techniken mühsam und haben eine geringe zeitliche Auflösung5,6.
Innerhalb des letzten Jahrzehnts hat die genetische Manipulation von Ctr mit der Einführung der Plasmidtransformation und Methoden zur Mutagenese7,8,9Fortschritte gemacht. Für diese Studie wurde ein Plasmid-basiertes System entwickelt, um die Chlamydienentwicklung bei einzelnen Einschlüssen in Echtzeit im Verlauf einer Infektion zu überwachen. Es wurde ein Chlamydien-Transformant erstellt, das sowohl einen RB- als auch einen EB-Zell-spezifischen Promoter-Reporter ausdrückte. Der RB-spezifische Reporter wurde durch Dieminierung des Promotors des frühen RB-Gens euo vor dem fluoreszierenden Protein Clover konstruiert. EUO ist ein Transkriptionsregulator, der eine Teilmenge der späten EB-assoziierten Gene10unterdrückt. Der Promotor von hctB, der ein Histon-ähnliches Protein kodiert, das an der EB-Nukleoidkondensation beteiligt ist, wurde direkt vor mKate2 (RFP) geklont, um den EB-spezifischen Reporter11zu erstellen. Das Rückgrat für hctBprom-mKate2/euoprom-Clover war p2TK2SW27. Die hctB- und euo-Promotoren wurden aus der genomischen DNA von Ctr-L2 verstärkt. Jede Promotorsequenz bestand aus 100 Basenpaaren vor dem vorhergesagten Transkriptionsstartort für das angegebene Chlamydasid-Gen plus den ersten 30 Nukleotid (10 Aminosäuren) des jeweiligen ORF. Die fluoreszierenden FP-Varianten wurden kommerziell als Ctr-Codon-optimierte Genblöcke erhalten und im Rahmen mit den ersten 30 Nukleotiden jedes Chlamydengens und Promotors geklont. Der incD-Terminator wurde direkt flussabwärts von mKate2 geklont. Der zweite Promoter-Reporter wurde flussabwärts des IncD-Terminators eingesetzt. Das Ampicillinresistenzgen (bla) in p2TK2SW2 wurde durch das AadA-Gen (Spectinomycin-Resistenz) von pBam4 ersetzt. Dies führte zum endgültigen Konstrukt p2TK2-hctBprom-mKate2/euoprom-Clover (Abbildung 1A), das in Ctr-L27umgewandelt wurde. Dieser RB/EB-Reporterstamm ermöglichte die Beobachtung des Entwicklungszyklus innerhalb einzelner Einschlüsse mittels Live-Zellmikroskopie (Abbildung 1B,C).
Unter Verwendung unseres Promoter-Reporter-Konstrukts in Kombination mit chemischer Mutagenese wurde ein Protokoll entwickelt, um einzelne Klone zu verfolgen und zu isolieren, die Entwicklungsanomalien aus mutagenisierten Populationen von Ctr serovar L2 aufwiesen. Dieses Protokoll ermöglicht die direkte Überwachung einzelner Chlamydieneinschlüsse, die Verfolgung der Genexpressionsprofile im Laufe der Zeit, die Identifizierung von Chlamydienklonen, die ein verändertes Entwicklungsgenexpressionsmuster exprimieren, und die klonale Isolierung von Chlamydien von einzelnen Einschlüssen.
Obwohl dieses Protokoll speziell für die Identifizierung von Genen erstellt wurde, die an der Entwicklung von Chlamyden beteiligt sind, könnte es leicht angepasst werden, um eine beliebige Anzahl von Chlamydien-Genwegen zu hinterfragen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Zersebung der Mechanismen, die den Chlamydien-Entwicklungszyklus steuern, wurde durch die Einschränkungen der derzeit verfügbaren genetischen Werkzeuge behindert. Mit unserem Promoter-Reporter Chlamydia in Verbindung mit der automatisierten Live-Zell-Mikroskopie wurde ein System entwickelt, das die Überwachung der Zelltypentwicklung bei einzelnen Einschlüssen über einen Zeitraum von 24 stunden ermöglicht. Dieses System hat in Kombination mit chemischer Mutagenese und direkter Inklusionsisolierung eine …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Dr. Anders Omsland von der Washington State University für die Versorgung der CIP-1 axenic Medien. Diese Arbeit wurde durch das NIH-Stipendium R01AI130072, R21AI135691 und R21AI113617 unterstützt. Zusätzliche Unterstützung wurde durch Start-up-Fonds der University of Idaho und des Center for Modeling Complex Interactions durch ihr NIH-Stipendium P20GM104420 bereitgestellt.
Materials
| 24-well polystyrene plates | Corning | 3524 | Cell culture growth for reinfection of isolates |
| 6-well glass bottom plates | Cellvis | P06-1.5H-N | Cell culture growth for imaging |
| 96-well glass bottom plates | Nunc | 165305 | Cell culture growth for imaging |
| Bold line CO2 Unit | OKO Labs | CO2 UNIT BL | Stage incubator CO2 control |
| Bold line T Unit | OKO Labs | H301-T-UNIT-BL-PLUS | Stage incubator temperature control |
| Borosilicate glass capillary tubes | Sutter Instrument | B1005010 | Capillary tubes |
| BrightLine bandpass emissions filter (514/30nm) | Semrock | FF01-514/30-25 | Fluoescent filter cube |
| BrightLine bandpass emissions filter (641/75nm) | Semrock | FF02-641/75-25 | Fluoescent filter cube |
| CellTram Vario | Eppendorf | 5196000030 | Microinjector |
| Chlamydia trachmatis serovar L2 | ATCC | VR-577 | Chlamydia trachomatis |
| CIP-1 media | In house | NA | Axenic media. IPB supplemented with 1% FBS, 25 μM amino acids, 0.5 mM G6P, 1.0 mM ATP, 0.5 mM DTT, and 50 μM GTP, UTP, and CTP. (Omsland, A. 2012) made in-house. |
| Cos-7 cells (ATCC) | ATCC | CRL-1651 | African green monkey kidney cell (host cells) |
| Cycloheximide | MP Biomedicals | 194527 | Host cell growth inhibitor |
| Ethyl methanesulfonate, 99% | Acros Organics | AC205260100 | Mutagen |
| Fetal Plex | Gemini Bio-Products | 100-602 | Supplement for base growth media |
| Fiji/ImageJ | https://imagej.net/Fiji | NA | Open sourse Image analysis software. https://imagej.net/Fiji |
| Galaxy 170 S CO2 incubator | Eppendorf | CO1700100X | Cell culture incubation |
| gblocks (Fluorescent FP variants: Clover and mKate2) | Integrated DNA Technologies | NA | gblock ORFs of Ctr optimized FP varients for cloning into p2TK2SW2 |
| Gentamycin 10mg/ml | Gibco | 15710-064 | Antibiotic for growth media |
| HBSS (Hank's Balanced Salt Solution) | Corning | 21-020-CM | Host cells rinse |
| Heparin sodium | Amersham Life Science | 16920 | inhibits and reverses the early electrostatic interactions between the host cell and EBs |
| HEPES 1M | GE Life Sciences | SH30237.01 | pH buffer for growth media |
| InjectMan | Eppendorf | 5179 000.018 | Micromanipulator |
| Jupyter Notebook | https://jupyter.org/ | NA | Visualization of inclusion traces. https://jupyter.org/ |
| Lambda 10-3 | Sutter Instrument | LB10-3 | Filter wheel controler |
| Oko Touch | OKO Labs | Oko Touch | Interface to control the Bold line T and CO2 Unit |
| Prior XY stage | Prior | H107 | Motorized XY microscope stage |
| PrismR Centrifuge | Labnet | C2500-R | Temperature controlled microcentrifuge |
| Problot Hybridization oven | Labnet | H1200A | Rocking Incubator for infection with Chlamydia |
| Proscan II | Prior | H30V4 | XYZ microscope stage controler |
| Purifier Class 2 Biosafety Cabinet | Labconco | 362804 | Cell culture work |
| RPMI-1640 (no phenol red) | Gibco | 11835-030 | Base growth media for imaging |
| RPMI-1640 (phenol red) | GE Life Sciences | SH30027.01 | Base growth media |
| scopeLED excitation LEDs (470nm,595nm) | scopeLED | F140 | Excitation light |
| Sonic Dismembrator Model 500 | Fisher Scientific | 15-338-550 | Sonicator, resuspending chlamydial pellet |
| Stage incubator | OKO Labs | H301-K-FRAME | Cluster well plate incubation chamber |
| sucrose-phosphate-glutamate buffer 1X (SPG) | In house | NA | Chlamydial storage buffer. (10 mM sodium phosphate [8 mM K 2HPO 4, 2 mM KH 2PO 4], 220 mM sucrose, 0.50 mM L-glutamic acid; pH 7.4) |
| T-75 Flasks | Thermo Scientific | 156499 | Cell culture growth |
| TE 300 inverted microscope | Nikon | 16724 | microscope |
| THOR LED | Thor Labs | LEDD1B | White light |
| Trypsin | Corning | 25-052-CI | Dislodges host cells from flask for seeding into plates |
| Zyla sCMOS | Andor | ZYLA-5.5-USB3 | imaging camera |
| µManager 2.0gamma | https://github.com/micro-manager/micro-manager | NA | Open sourse automated microscope control software package |
Referencias
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