Approche génétique avancée des cellules vivantes pour identifier et isoler les mutants du développement dans chlamydia trachomatis
Summary
Ce protocole utilise des promoteurs-reporters fluorescents, la microscopie à cellules vivantes et l’extraction individuelle d’inclusion dans une approche génétique dirigée vers l’avant pour identifier et isoler les mutants développementaux de Chlamydia trachomatis.
Abstract
L’agent pathogène bactérien intracellulaire Chlamydia trachomatis subit un cycle de développement composé de deux formes morphologiquement discrètes de développement. Le corps élémentaire non réplictif (EB) initie l’infection de l’hôte. Une fois à l’intérieur, l’EB se différencie dans le corps réticulé (RB). Le RB subit ensuite plusieurs tours de réplication, avant de se différencier de la forme EB infectieuse. Ce cycle est essentiel pour la survie chlamydial car l’échec de passer d’un type de cellule à l’autre empêche l’invasion de l’hôte ou la réplication.
Les limitations des techniques génétiques dues à la nature intracellulaire obligatoire de la chlamydia ont entravé l’identification des mécanismes moléculaires impliqués dans le développement de type cellulaire. Nous avons conçu un nouveau système plasmide double promoteur-reporter qui, en conjonction avec la microscopie à cellules vivantes, permet la visualisation du type de cellule commutation en temps réel. Pour identifier les gènes impliqués dans la régulation du développement de type cellulaire, le système promoteur-reporter de cellules vivantes a été mis à profit pour le développement d’une approche génétique avancée en combinant la mutagénèse chimique de la souche double reporter, l’imagerie et le suivi de la chlamydia avec la cinétique développementale altérée, suivie de l’isolement clonal des mutants. Ce flux de travail génétique avancé est un outil flexible qui peut être modifié pour l’interrogatoire dirigé dans un large éventail de voies génétiques.
Introduction
Chlamydia trachomatis (Ctr) est un pathogène intracellulaire obligatoire qui progresse à travers un cycle de développement biphasique qui est essentiel pour sa survie et la prolifération1. Ce cycle se compose de deux formes développementales, le corps élémentaire (EB) et le corps réticulé (RB). L’EB est incompétent de réplication mais médiateur l’invasion de cellules par l’endocytose induite par effecteur2. Une fois dans l’hôte, l’EB mûrit à la RB réplicative. Le RB effectue plusieurs séries de réplication avant de convertir à l’EB afin d’initier des séries ultérieures d’infection.
La gamme limitée d’outils génétiques a limité la plupart de la recherche chlamydiale aux études biochimiques ou à l’utilisation de systèmes de substitution. En conséquence, l’élucidation de la régulation génique et le contrôle du cycle de développement a été difficile3,4. L’un des défis les plus importants dans le domaine chlamydial est le suivi temporel à haute résolution du cycle de développement chlamydial et l’identification des protéines impliquées dans sa régulation. L’expression génique pendant le cycle de développement chlamydial a traditionnellement été effectuée par des méthodes destructrices de « point d’extrémité » comprenant RNAseq, qPCR et microscopie à cellules fixes5,6. Bien que ces méthodes aient fourni des informations inestimables, les techniques employées sont laborieuses et ont une faible résolution temporelle5,6.
Au cours de la dernière décennie, la manipulation génétique de Ctr a progressé avec l’introduction de la transformation plasmide et des méthodes pour la mutagenèse7,8,9. Pour cette étude, un système à base de plasmide a été développé pour surveiller le développement chlamydial dans les inclusions individuelles en temps réel au cours d’une infection. Un transformateur chlamydial a été créé qui a exprimé à la fois un RB et EB cellule de type spécifique promoteur-reporter. Le journaliste spécifique rb a été construit en fusionnant le promoteur du gène RB euo début en amont de la protéine fluorescente Clover. EUO est un régulateur transcriptionnel qui réprime un sous-ensemble de gènes associés à l’EB10. Le promoteur de hctB, qui code une protéine histone-like impliqués dans la condensation nucléoïde EB, a été cloné directement en amont de mKate2 (RFP) pour créer le journaliste spécifique EB11. L’épine dorsale pour hctBprom-mKate2/euoprom-Clover était p2TK2SW27. Les promoteurs hctB et euo ont été amplifiés à partir de l’ADN génomique Ctr-L2. Chaque séquence de promoteur se composait d’environ 100 paires de base en amont du site de début de transcription prévu pour le gène chlamydial spécifié plus les 30 premiers nucléotides (10 acides aminés) de l’ORF respectif. Les variantes fluorescentes fp ont été obtenues commercialement comme blocs de gènes optimisés Ctr codon et clonés dans le cadre avec les 30 premiers nucléotides de chaque gène chlamydial et promoteur. Le terminateur incD a été cloné directement en aval de mKate2. Le deuxième promoteur-reporter a été inséré en aval du terminateur incD. Le gène de résistance à l’ampicilline (bla) dans p2TK2SW2 a été remplacé par le gène aadA (résistance à la spitinomycine) de pBam4. Cela a abouti à la construction finale p2TK2-hctBprom-mKate2/euoprom-Clover (Figure 1A) qui a été transformé en Ctr-L27. Cette souche de journaliste RB/EB a permis l’observation du cycle de développement dans des inclusions individuelles utilisant la microscopie à cellules vivantes (figure 1B,C).
Utilisant notre construction promoteur-reporter en combinaison avec la mutagenèse chimique, un protocole a été conçu pour suivre et isoler les clones individuels qui ont montré des anomalies développementales des populations mutagéenisées de Ctr serovar L2. Ce protocole permet la surveillance directe des inclusions chlamydiales individuelles, le suivi des profils d’expression des gènes au fil du temps, l’identification des clones chlamydial qui expriment un modèle modifié d’expression des gènes développementaux, et l’isolement clonal de chlamydia des inclusions individuelles.
Bien que ce protocole ait été créé spécifiquement pour l’identification des gènes impliqués dans le développement chlamydial, il pourrait être facilement adapté pour interroger n’importe quel nombre de voies génétiques chlamydiales.
Protocol
Representative Results
Discussion
La dissection des mécanismes qui contrôlent le cycle de développement chlamydial a été entravée par les limites des outils génétiques actuellement disponibles. Utilisant notre promoteur-reporter Chlamydia en conjonction avec la microscopie automatisée à cellules vivantes, un système a été construit qui permet la surveillance du développement de type cellulaire dans les inclusions individuelles sur une période de 24 h. Ce système, combiné à la mutanéèse chimique et à l’isolement de l’incl…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions le Dr Anders Omsland de l’Université d’État de Washington d’avoir fourni les médias axeniques CIP-1. Ce travail a été soutenu par la subvention des NIH R01AI130072, R21AI135691 et R21AI113617. Un soutien supplémentaire a été fourni par des fonds de démarrage de l’Université de l’Idaho et du Center for Modeling Complex Interactions par le biais de leur subvention P20GM104420 des NIH.
Materials
| 24-well polystyrene plates | Corning | 3524 | Cell culture growth for reinfection of isolates |
| 6-well glass bottom plates | Cellvis | P06-1.5H-N | Cell culture growth for imaging |
| 96-well glass bottom plates | Nunc | 165305 | Cell culture growth for imaging |
| Bold line CO2 Unit | OKO Labs | CO2 UNIT BL | Stage incubator CO2 control |
| Bold line T Unit | OKO Labs | H301-T-UNIT-BL-PLUS | Stage incubator temperature control |
| Borosilicate glass capillary tubes | Sutter Instrument | B1005010 | Capillary tubes |
| BrightLine bandpass emissions filter (514/30nm) | Semrock | FF01-514/30-25 | Fluoescent filter cube |
| BrightLine bandpass emissions filter (641/75nm) | Semrock | FF02-641/75-25 | Fluoescent filter cube |
| CellTram Vario | Eppendorf | 5196000030 | Microinjector |
| Chlamydia trachmatis serovar L2 | ATCC | VR-577 | Chlamydia trachomatis |
| CIP-1 media | In house | NA | Axenic media. IPB supplemented with 1% FBS, 25 μM amino acids, 0.5 mM G6P, 1.0 mM ATP, 0.5 mM DTT, and 50 μM GTP, UTP, and CTP. (Omsland, A. 2012) made in-house. |
| Cos-7 cells (ATCC) | ATCC | CRL-1651 | African green monkey kidney cell (host cells) |
| Cycloheximide | MP Biomedicals | 194527 | Host cell growth inhibitor |
| Ethyl methanesulfonate, 99% | Acros Organics | AC205260100 | Mutagen |
| Fetal Plex | Gemini Bio-Products | 100-602 | Supplement for base growth media |
| Fiji/ImageJ | https://imagej.net/Fiji | NA | Open sourse Image analysis software. https://imagej.net/Fiji |
| Galaxy 170 S CO2 incubator | Eppendorf | CO1700100X | Cell culture incubation |
| gblocks (Fluorescent FP variants: Clover and mKate2) | Integrated DNA Technologies | NA | gblock ORFs of Ctr optimized FP varients for cloning into p2TK2SW2 |
| Gentamycin 10mg/ml | Gibco | 15710-064 | Antibiotic for growth media |
| HBSS (Hank's Balanced Salt Solution) | Corning | 21-020-CM | Host cells rinse |
| Heparin sodium | Amersham Life Science | 16920 | inhibits and reverses the early electrostatic interactions between the host cell and EBs |
| HEPES 1M | GE Life Sciences | SH30237.01 | pH buffer for growth media |
| InjectMan | Eppendorf | 5179 000.018 | Micromanipulator |
| Jupyter Notebook | https://jupyter.org/ | NA | Visualization of inclusion traces. https://jupyter.org/ |
| Lambda 10-3 | Sutter Instrument | LB10-3 | Filter wheel controler |
| Oko Touch | OKO Labs | Oko Touch | Interface to control the Bold line T and CO2 Unit |
| Prior XY stage | Prior | H107 | Motorized XY microscope stage |
| PrismR Centrifuge | Labnet | C2500-R | Temperature controlled microcentrifuge |
| Problot Hybridization oven | Labnet | H1200A | Rocking Incubator for infection with Chlamydia |
| Proscan II | Prior | H30V4 | XYZ microscope stage controler |
| Purifier Class 2 Biosafety Cabinet | Labconco | 362804 | Cell culture work |
| RPMI-1640 (no phenol red) | Gibco | 11835-030 | Base growth media for imaging |
| RPMI-1640 (phenol red) | GE Life Sciences | SH30027.01 | Base growth media |
| scopeLED excitation LEDs (470nm,595nm) | scopeLED | F140 | Excitation light |
| Sonic Dismembrator Model 500 | Fisher Scientific | 15-338-550 | Sonicator, resuspending chlamydial pellet |
| Stage incubator | OKO Labs | H301-K-FRAME | Cluster well plate incubation chamber |
| sucrose-phosphate-glutamate buffer 1X (SPG) | In house | NA | Chlamydial storage buffer. (10 mM sodium phosphate [8 mM K 2HPO 4, 2 mM KH 2PO 4], 220 mM sucrose, 0.50 mM L-glutamic acid; pH 7.4) |
| T-75 Flasks | Thermo Scientific | 156499 | Cell culture growth |
| TE 300 inverted microscope | Nikon | 16724 | microscope |
| THOR LED | Thor Labs | LEDD1B | White light |
| Trypsin | Corning | 25-052-CI | Dislodges host cells from flask for seeding into plates |
| Zyla sCMOS | Andor | ZYLA-5.5-USB3 | imaging camera |
| µManager 2.0gamma | https://github.com/micro-manager/micro-manager | NA | Open sourse automated microscope control software package |
Referencias
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