Cristallographie aux rayons X pour étudier la transition oligomérique de l’État de la Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

L’oligomérisation est un processus prédominant qui dicte les fonctions biologiques de nombreuses protéines. Dans Escherichia coli, on estime que seulement 35% des protéines sont monomères¹. Certaines protéines, appelées morphéines, peuvent même adopter plusieurs états oligomériques avec des sous-unités ayant une structure distincte dans chaque état oligomérique². La transition entre leurs états oligomériques est souvent un moyen de réguler l’activité protéique car chaque état oligomérique peut avoir une activité ou une fonction spécifique différente. Plusieurs exemples de morphétines ont été bien documentés dans la littérature, notamment la synthase porphobilinogen³, HPr kinase/phosphatase⁴, Lon protease⁵, lactate dehydrogenase⁶, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase⁷, pyruvate kinase⁸, synthase citrate⁹, et ribonuclease A¹⁰. Récemment, nous avons décrit l’aminopeptidase M42 TmPep1050, un autre exemple d’enzyme avec un comportement morphéine, dont l’activité dépend de ses états oligomériques¹¹. La transition entre ses états oligomériques est médiée par ses cofacteurs métalliques qui induisent plusieurs modifications structurelles des sous-unités.

La famille des aminopeptidase M42 appartient au clan MH^12,13, et est largement répartie entre bactéries et archée¹⁴. Les aminopeptidases M42 sont de véritables enzymes dinucléaires dégradant les peptides jusqu’à 35 résidus d’acides aminés de^{longueur 15.} Ils adoptent une structure particulière en forme de tétraèdre faite de 12 sous-units avec leurs sites actifs orientés vers une cavité intérieure. Un tel arrangement est souvent décrit comme une nano-compartimentation de l’activité pour éviter la protéolyse incontrôlée. La fonction physiologique des aminopeptidases M42 peut être associée aux peptides hydrolysants protéasomes résultant de la dégradation des^{protéines 16,17}. Pyrococcus horikoshii possède quatre aminopeptidases M42, chacune présentant des spécificités distinctes mais complémentaires^18,19,20,21. Singulièrement, des hétérocomplexes faits de deux types différents de sous-unités ont été décrits dans P. horikoshii,suggérant l’existence des complexes peptidasome^22,23.

Plusieurs structures de M42 aminopeptidases ont été décrites dans la^{littérature 11,16,18,19,20,24,25,26}. Le sous-unité est composé de deux domaines distincts, d’un domaine catalytique et d’un domaine de dimérisation. Le domaine catalytique adopte un pli α/β commun conservé dans tout le clan MH, le domaine catalytique archétypal étant l’aminopeptidase Ap1 de Vibrio proteolyticus²⁷. Le domaine de la dimérisation adopte un pli¹⁶ en forme de PDZ et peut avoir, en plus de son rôle dans l’oligomérisation, un rôle dans le contrôle de l’accès au substrat et la liaison dans la cavité^{interne 11}. Comme le bloc de base est un dimère, le dodécaamer est souvent décrit comme l’association de six dimers, chaque dimer étant placé à chaque bord du tétraèdre¹⁶. L’oligomérisation des aminopeptidases M42 repose sur la disponibilité de ses cofacteurs métalliques. Les ions métalliques Divalent, souvent Zn²⁺ et Co^2+,sont catalytiques impliqués dans la liaison peptidique et l’hydrolyse. On les trouve dans deux sites de liaison distincts, à savoir les sites M1 et M2. Les deux ions métalliques conduisent et accordent finement l’oligomérisation comme démontré pour PhTET2, PhTET3, PfTET3, et TmPep1050^11,24,28,29. Lorsque les cofacteurs métalliques sont épuisés, le dodecamer se démonte en dimers, comme dans PhTET2, PhTET3, et TmPep1050^11,16,28, ou même des monomères, comme dans PhTET2 et PfTET3^24,29.

Présenté ici est un protocole utilisé pour étudier les structures des oligomers TmPep1050. Ce protocole est un ensemble de méthodes communes comprenant la purification de protéine, le criblage protéolytique d’activité, la cristallisation, la diffraction de rayon X, et le remplacement moléculaire. Les subtilités inhérentes au traitement des métalloenzymes, de l’oligomérisation des protéines, de la cristallisation des protéines et du remplacement moléculaire sont soulignées. Un cas d’étude est également présenté pour montrer si tmPep1050 dodecamers peut se dissocier davantage en monomères ou non. Pour répondre à cette question, une variante tmpep1050, TmPep1050_{H60A H307A}, a été étudiée dont les sites de liaison métallique sont altérés par la mutation de His-60 (site M2) et His-307 (site M1) en résidus d’Ala. Ce protocole peut être hébergé pour étudier d’autres aminopeptidases M42 ou tout métalloenzymes avec un comportement morpheein-like.