Manuskriptet presenterar på plats provtagning av mänskliga hjärntumörer med fast fas mikroextraktion följt av deras biokemiska profilering mot upptäckten av biomarkörer.
Trots de olika verktyg som finns tillgängliga för cancerdiagnos och klassificering, metoder som möjliggör snabb och enkel karakterisering av tumörer är fortfarande i behov. Under de senaste åren har masspektrometri blivit en metod för val för oriktad profilering av diskriminerande förening som potentiella biomarkörer för en sjukdom. Biofluider anses i allmänhet som att föredra matriser med tanke på deras tillgänglighet och enklare provbearbetning medan direkt vävnadsprofilering ger mer selektiv information om en viss cancer. Beredning av vävnader för analysen via traditionella metoder är mycket mer komplex och tidskrävande, och därför inte lämplig för snabb analys på plats. Det nuvarande arbetet presenterar ett protokoll som kombinerar prov beredning och extraktion av små molekyler på plats, omedelbart efter tumör samband. Provtagningsanordningen, som är av storleken på en akupunkturnål, kan sättas in direkt i vävnaden och sedan transporteras till det närliggande laboratoriet för instrumental analys. Resultaten av metabolomik och lipidomics analyser visar förmåga av tillvägagångssättet för inrättandet av fenotyper av tumörer relaterade till histologiska ursprunget av tumör, malignitet och genetiska mutationer, samt för urval av diskriminerande föreningar eller potentiella biomarkörer. Teknikens icke-förstörande karaktär tillåter efterföljande prestanda hos rutinmässigt använda tester t.ex.
Magnetic Resonance Imaging (MRI) och datortomografi (CT) är de huvudsakliga metoder som används för den verkliga tidsanalysen av hjärnlesioner. Hjärntumör differentiering är i allmänhet baserat på histopatologi med ytterligare färgning och avancerade immunohistochemical tekniker. Enligt den uppdaterade vägledningen om centrala nervösa hjärntumörer som utfärdats av Världshälsoorganisationen (WHO) i 2016, genetiska tester är avgörande för differentiering och klassificering av dessa tumörer1. Differentiering och klassificering av tumörer tillåter läkare att välja den mest effektiva behandlingen för en given typ av tumör därigenom utöka den förväntade livslängden för patienten. Tyvärr, trots tillgången på sådana avancerade metoder för att hjälpa läkare att välja en optimal behandling för sina patienter, den förväntade livslängden för patienter som diagnostiserats med glioblastom (IV grad gliom) är bara ca 15-16 månader2. Även med förfining och ökad noggrannhet av nämnda bildbehandling och histologiska metoder som diagnostiska verktyg, finns det fortfarande ett stort behov av nya tekniker som kan erbjuda kompletterande information för att hjälpa läkare i beslut om behandlingskurs. Under de senaste åren har flera nya tillvägagångssätt baserade på masspektrometri föreslagits för intraoperativ analys av cancer3,4. Potentialen för solid fas mikroextraktion (SPME), den metod som presenteras häri, som en snabb på plats analysverktyg, har redan visats i en mängd olika studier5. Det nuvarande manuskriptet visar en av de kliniska tillämpningar av metoden, oriktade metabolomik och lipidomics av mänskliga hjärntumörer. Oriktade utredningar presenterar en viktig utgångspunkt vid upptäckten av potentiella biomarkörer. När sådana biomarkörer har etablerats kan de sedan användas som diagnostiska referenser för att skilja mellan tumörer med samma teknik som är kopplade till instrumentering på plats.
SPME är en jämviktsbaserad provberedningsteknik som extraherar små molekyler från provmatriser med användning av små mängder extraktionsfas. I SPME: s mest traditionella konfiguration av enheten (sond), är en fiber belagd med en lämplig extraktionsfas och immobiliseras på ett fast stöd dvs, en metalltråd5,6. Biokompatibla beläggningar och anordningar (sonder) möjliggör extraktion direkt från komplexa biologiska matriser utan provförbehandling t.ex. Genom extraktionsprocessen är analyter partitionerade mellan extraktionsfasen och provmatrisen i proportion till deras ursprungliga koncentrationer. Om extraktion utförs tillräckligt länge, då jämvikt uppnås. Medan utvinning vid jämvikt ger högsta möjliga känslighet och reproducerbarhet, är utvinning i förväg också möjlig och till och med att föredra i vissa fall dvs. Extraktionstidsprofilen för en given analyt påverkas i allmänhet av de fysikaliska kemiska egenskaperna hos analyten, den matris som provbeskar, vilken typ av sorbent som används, och flera andra extraktionsförhållanden. Den uppsjö av faktorer som styr deras utvinning kinetik gör det praktiskt omöjligt att säkerställa jämviktsutsug av alla föreningar när oriktade analyser såsom metabolomik eller lipidomics utförs. Av ovan nämnda skäl fastställdes utvinningstiden för det nuvarande protokollet godtyckligt för att garantera tillfredsställande känslighet och täckning av metaboliter å ena sidan, och praktiskhet för användning på plats å andra sidan.
Det bör betonas att den mycket lilla storleken på sonder som används för extraktion av prov från vävnader endast orsakar minsta vävnadsskada medan själva provtagningsförfarandet inte förbrukar någon vävnad men mycket små mängder av små molekyler från det provsmakade området; därför kan samma prov användas ytterligare för rutintester dvs, histologiska eller genetiska, vilket möjliggör uppnåendet av väsentlig och kompletterande information från samma prov. Sådana kompletterande, omfattande data skulle möjliggöra en bättre förståelse av tumörbiologi, förhoppningsvis underlätta upptäckten av nya behandlingsmål. Om du utnyttjar denna metod ökar ytterligare möjligheten till intraoperativ diagnostik på plats när målbiomarkörer fastställs.
Nedan presenterar vi protokoll för provtagning av hjärntumörer på plats för metabolomik och lipidomics analyser och databehandling.
Oriktade metabolomik och lipidomics används ofta i studier inriktade på att identifiera tumör biomarkörer. Emellertid, i de flesta fall, forskare leta efter föreningar som kan användas för screening av sjukdomen. Följaktligen är de föredragna biologiska proverna blod eller urin på grund av deras relativt enkel åtkomst. Analys av tumörvävnad utförs främst för att förstå mekanismerna bakom sjukdomen, karakterisera olika tumörtyper etc. Analys på plats av tumörbiomarkörer utförs sällan, eftersom sådana tillämpningar kräver omfattande provberedning. Alternativt, strategier baserade på realtidsanalys av vävnadsprofiler utan förval av specifika biomarkörer tjänar uppmärksamhet av det medicinska samfundet3,4. Lösningen som presenteras häri ger ett annat perspektiv på vävnadsbearbetning på plats genom att avtäcka den typ av information som kan erhållas via sådana metoder.
Kombinationen av provtagning, provberedning och extraktion gör SPME som ett mycket användbart verktyg för analys på plats. Dessutom möjliggör bristande vävnadskonsumtion under provtagningen ytterligare användning av samma prover för biomarköranalys och rutintester (genotypning, histologisk analys), därför, vilket lägger till ny information till resultaten av standardtestning. Provtagningsanordningen har en mycket enkel design, dess funktion är mycket lätt, och ingen särskild utbildning krävs för att utföra extraktionen själv. Men att uppnå tillförlitliga resultat kräver mycket mer än bara korrekt hantering av enheter. För att korrekt utföra experimentet måste man förstå extraktionsprocessen, provets natur och vara medveten om potentiella misstag som kan påverka data.
Det är viktigt att överväga heterogeniteten i cancervävnad10; proverade tumörer kan innehålla delar som genomgår nekros, förkalkning och hypoxi, och var och en av dessa processer kommer att återspeglas i metabolom och lipidome uppnås, vilket påverkar resultat. Därför rekommenderas att rumslig upplösningsprovtagning utförs genom insättning av flera fibrer i olika delar av cancervävnaden, eller alternativt, att en längre beläggning ska användas för att penetrera hela tumören så att man får genomsnittlig information om tumören. Om den rumsliga upplösningens provtagningsmetod utförs, kan fibrer alla desorberas till ett desorptionslösningsmedel; detta skulle inte bara möjliggöra uppnåendet av övergripande information om tumören, men också öka känsligheten i analysen. Alternativt skulle desorption av enskilda fibrer i separata injektionsflaska göra det möjligt för undersökningar att räkna ut den inre mångfalden av hjärntumören, som består av kärnan byggd av cancerceller, och den yttre zonen, som är gränsen för frisk vävnad. Djupare delar av tumören är oftast mer skadade av de processer som rör cancer11. Emellertid, utredare måste tänka på att detta alternativ äventyrar metod känslighet och det totala antalet detekterbara föreningar. I det aktuella arbetet användes en 7 mm beläggning; denna längd ansågs vara optimal för olika storlekar av tumörer som ingår i studien. Beläggningarna trängde in i tumörerna, och gav därmed icke-speciell upplösning, men i genomsnitt data över provet. Oavsett vilket protokoll som valts är det viktigt att samma protokoll följs under hela studien, inklusive antalet fibrer som används för individuell provtagning, längden på beläggningen, extraktionstid, och alla andra faktorer som avgränsas i detta arbete.
Det är viktigt att kontrollera analysens kvalitet. Den poolade QC (se steg 4.7 och 7.7 i protokollet) bör förberedas och användas för övervakning av instrumentstabilitet under körningen av hela provbaten. De tomma kontrollerna (se steg 2.8) kan senare användas för att förbereda en “undantagslista” för att eliminera signaler av föroreningar som härrör från lösningsmedel eller fibertillverkning. Vid speciella tillfällen, såsom en risk för kontaminering, är det nödvändigt att utföra provtagning från handskar, bord, apparatur eller andra ytor som kan utgöra en kontaminationsrisk. I sådana fall är fiberpreparering, tidpunkt för extraktion och desorptionsprotokoll samma som för proverna.
Metabolomiska och lipidomiska analyser är helt inriktade på små molekyler (mindre än 1 500 Da) som förekommer i en organism eller specifika komponenter i organismen, såsom specifika organ, vävnad, vätskor, celler etc. Metabolomic och lipidomics erbjuder en ögonblicksbild av biokemiska förändringar som sker i kroppen, och när det gäller cancer, integrerar de information som rör genomet, histologi och malignitet av tumören. Dessa omikvetenskaper skapar en koppling mellan fysiologi och fenotyp då metaboliter är högre upp i den biokemiska stegen än proteiner eller gener12. Genom att förstå metabolom och lipidome av cancertumörer, kommer vi närmare att upptäcka fenotyp bland alla -omics vetenskaper som dessa grenar av studien erbjuder mer djupgående kunskap om dynamiska förändringar av molekyler som ett svar av levande organismer till olika stimuli. Som presenteras i detta arbete, de uppgifter som erhållits i ett urval motsvarar histologi av cancer, dess grad av malignitet, och det återspeglar förändringar som sker på genomet nivå. I gliomas, som den typ av cancer av intresse i denna studie, den information som döljer i arvsmassan är särskilt viktigt, som en personlig behandling utvecklas baserat på resultaten av genetiska tester. Särskilda mutationer är prognostiska markörer för resultaten av cellgifter- eller strålbehandling. Som visat här, är valet av biomarkörer som återspeglar en given mutation möjlig med den föreslagna strategin. Mutation markörer, liksom ytterligare deskriptorer typer som de som anger graden av malignitet av tumören kan också användas för att stödja rutinmässiga diagnostiska metoder.
Ex vivo kemisk biopsi med användning av fast fas mikroextraktion fibrer är det första steget i tillämpningen av metoden till intraoperativ diagnostik. Metoden kan enkelt antas för in vivo-provtagning i väntan på tillstånd från lämpliga Etiska nämnder. I sådana fall måste sterilisering av SPME-apparater utföras enligt de accepterade steriliseringsförfarandena på det sjukhus där provtagning ska genomföras, dvs. De förbetingade och steriliserade fibrerna måste förvaras i förseglade förpackningar märkta med ett steriliserings utgångsdatum. Det är viktigt att notera att fibrer inte bör rengöras med användning av ytaktiva ämnen. Ett sådant förfarande kan orsaka ospecifika förändringar i sorbentsammansättning, vilket påverkar extraktionen av analyter. I de studier som beskrivs här användes en utvinningsperiod på 30 min, men andra rapporter bekräftar att kortare tider kan ge tillfredsställande resultat i in vivo-studierna 13. Huq et al. visade att analyt jämviktstid uppnås snabbare i vävnad, som en komplex matris, än i enkla matriser14. Reproducerbarheten av de erhållna resultaten kan dock äventyras under kortare extraktionsperioder eftersom fler analyter kommer att utvinnas under förutjämviktsförhållanden; därför måste exakt tidskontroll genomföras.
Båda omikvetenskaper som utnyttjas som en del av detta arbete har utmärkt potential som biomarkör upptäckt verktyg. När biomarkörer valts eller en kemometrisk modell är etablerad kan medicinsk diagnostik som bygger på bestämning av målmetaboliter via metoder som gäller för undersökningar på plats, såsom den SPME-metod som beskrivs i detta arbete, utvecklas och implementeras som en del av rutindiagnostik.
Protokollet som föreslås i det aktuella manuskriptet beskriver hur man utför oriktade metabolomic och lipidomic analyser av cancer vävnad med hjälp av fasta fas mikroextraktion för screening av potentiella biomarkörer. Den är utformad för att möjliggöra utvinning av representativa föreningar, differentiering av tumörer, och identifiering av diskriminerande föreningar som karakteriserar en viss cancer, dvs. De oriktade analyser med SPME som beskrivs i denna artikel utgör en utgångspunkt i utvecklingen av snabb intraoperativ diagnostik, där en utvald panel av föreningar kan bestämmas utan nödvändighet för screening av alla föreningar som finns i provet. Av intresse för snabba diagnostiska resultat skulle SPME-sonder som används för utvinning på plats kunna kopplas direkt till analytisk instrumentering som finns i sjukhusanläggningen. Enkla extraktioner som utförs med minsta provberedning följt av kromatografifri analys skulle avsevärt förkorta den totala tiden från timmar till några minuter, som redan beskrivits för läkemedelsövervakning15.
The authors have nothing to disclose.
Studien fick stöd av grant Harmonia 2015/18/M/ST4/00059 från National Science Centre. Författarna vill erkänna MilliporeSigma, ett företag av Merck KGaA, Darmstadt, Tyskland, för att tillhandahålla SPME-enheter som används i detta arbete. Life science-verksamheten i Merck fungerar som MilliporeSigma i USA och Kanada. Dessutom vill författarna tacka Thermo Fisher Scientific för tillgång till Q-Exactive Focus orbitrap masspektrometer.
Författarnas bidrag: JB: optimering av provberedning och LC-MS-parametrar, prestanda hos SPME-LC-MS-experiment, dataanalys, statistisk analys och datatolkning och manuskriptberedning som rör lipidomics-delen; PZG: samordning och prestanda av majoriteten av provtagningar på sjukhus, optimering av provtagnings- och provberedningsparametrar, prestanda hos SPME-LC-MS-experiment, dataanalys, statistisk analys och datatolkning, manuskriptberedning som relaterar till metabolomikdel; MG – hjälp vid optimering av provberedning, LC-MS-metod och dataanalys som rör lipidomicsdel; KG: co-performance av SPME-provtagningar och optimering av provtagning och provberedning, SPME-LC-MS-analys relaterad till metabolomikdel; KC: prestanda av flera SPME provtagningar på sjukhus, hjälp vid optimering av provtagning, provberedning och dataanalys relaterad till metabolomikdel; KJ: prestanda av flera SPME provtagningar på sjukhus, hjälp i lipidomics analys; DP: prestanda av kirurgiska ingrepp, rekrytering av patienterna; JF: prestanda av kirurgiska ingrepp, rekrytering av patienterna; MH: prestanda av kirurgiska ingrepp, samordning av klinisk del av forskningen; BB: koncept, samordningstillsyn av projektet och manuskriptberedning, utförande av flera provtagningar
acetic acid | Honeywell | 49199 | Mobile phase additive, LCMS grade |
acetonitrile | Honeywell | 34967 | HPLC solvent, LCMS grade |
ammonium acetate | Honeywell | 14267 | Mobile phase additive, LCMS grade |
BenchMixer MultiTube Vortexer | Benchmark Scientific | BV1010* | Vortex mixer |
caps | Agilent | 5183-2076 | Blue scrw tp,pre-slit PTFE/Si septa |
Compound Discoverer 2.1 | Thermo Scientific | software for data processing | |
Discovery HS F5 Supelguar Cartridge 2 cm × 2.1 mm, 3 μm | Supelco | 567571-U | Guard Column |
Discovery HS F5, 2.1 mm x 100 mm, 3 μm | Merck | 567502-U | HPLC Column |
formic acid | Honeywell | 56302 | Mobile phase additive, LCMS grade |
glass vial inserts 250ul , deactivated | Agilent | 5181-8872 | |
glass vial inserts 350ul | Agilent | 5188-5321 | |
glass vials 1.5ml | Agilent | 5183-2030 | |
glass vials, 2 mL (amber, deactivated) | Agilent | 5183-2072 | |
glass vials, 2mL | Agilent | 5182-0715 | |
HILIC Luna 3 μm, 200A, 100 x 2.0 mm | Shim-Pol | PHX-00D-4449-B0 | HPLC Column |
isopropanol | Honeywell | 34965 | HPLC solvent, LCMS grade |
LipidSearch 4.1 | Thermo Scientific | software for data processing | |
Metaboanalyst | Xia Lab @ McGill | online software for statistical analysis (Chong, J., Wishart, D.S. and Xia, J. (2019) Using MetaboAnalyst 4.0 for Comprehensive and Integrative Metabolomics Data Analysis. Current Protocols in Bioinformatics 68, e86 ) | |
methanol | Honeywell | 34966 | HPLC solvent, LCMS grade |
Pierce LTQ Velos ESI Positive Ion Calibration Solution | Thermo Scientific | 88323 | |
Pierce Negative Ion Calibration Solution | Thermo Scientific | 88324 | |
Q Exactive Focus hybrid quadrupole-Orbitrap MS | Thermo Scientific | 726049 | Mass Spectrometer |
SecurityGuard cartridge for HILIC, 4 mm × 2.0 mm | Phenomenex | KJ0-4282 | Guard Column |
SeQuant ZIC-cHILIC 3µm,100Å 100 x 2.1 mm | Merck | 1506570001 | HPLC Column |
SeQuant ZIC-HILIC Guard Kit 20 x 2.1 mm | Supelco | 1504360001 | Guard column |
SPME LC fiber probes, C18 | Supelco | custom order | comercial probes: 57281-U; probes used in the experiment were not needle assembled and were precut to the length described in the protocol |
SPME LC fiber probes, mixed Mode | Supelco | custom order | |
UltiMate 3000 HPLC systems | Thermo Scientific | 5200.0345 | HPLC system |
water | Merck | 1153331000 | HPLC solvent, LCMS grade |
XSelect CSH C18 3.5μm 2.1x75mm | Waters | 186005644 | HPLC Column |
XSelect CSH C18 VanGuard Cartridge, 3.5 µm, 3.9×5 mm | Waters | 186007813 | Column cartidge |