Metabolomik ve Lipidomik Analizler için Beyin Tümörlerinin Yerinde Örnekleme sivesi ve ekstraksiyonu
Summary
El yazması, katı faz mikroekstraksiyonu ile insan beyin tümörlerinin yerinde örneklemesini ve ardından biyobelirteçlerin keşfine yönelik biyokimyasal profillemelerini sunmaktadır.
Abstract
Kanser tanısı ve sınıflandırılması için mevcut araçların çeşitliliğine rağmen, tümörlerin hızlı ve basit karakterizasyonuna olanak sağlayan yöntemlerhala ihtiyaç duymaktadır. Son yıllarda, kütle spektrometresi bir hastalığın potansiyel biyobelirteçleri olarak ayrımcı bileşiğin hedeflenmemiş profilleme için tercih edilen bir yöntem haline gelmiştir. Biyoakışkanlar genellikle erişilebilirlik ve daha kolay örnek işleme verilen tercih edilen matrisler olarak kabul edilirken, doğrudan doku profilleme belirli bir kanser hakkında daha seçici bilgi sağlar. Geleneksel yöntemlerle analiz için dokuların hazırlanması çok daha karmaşık ve zaman alıcıdır ve bu nedenle hızlı yerinde analiz için uygun değildir. Mevcut çalışma, tümör rezeksiyonundan hemen sonra, numune hazırlama ve küçük moleküllerin yerinde çıkarılmasını birleştiren bir protokol sunmaktadır. Akupunktur iğnesi büyüklüğünde olan numune alma cihazı doğrudan dokuya takılabilir ve daha sonra enstrümental analiz için yakındaki laboratuvara taşınabilir. Metabolomik ve lipidomik analizlerin sonuçları, tümörün histolojik kökeni, malignite ve genetik mutasyonların yanı sıra ayrımcı bileşiklerin veya potansiyel biyobelirteçlerin seçimine bağlı tümörlerin fenotiplerinin kurulması için yaklaşımın yeteneğini göstermektedir. Tekniğin tahribatsız doğası, SPME analizinde kullanılan aynı numuneler üzerinde rutin olarak kullanılan testlerin, örneğin histolojik testlerin sonraki performansına izin vererek kişiselleştirilmiş tanılamayı desteklemek için daha kapsamlı bilgilere ulaşılmasını sağlar.
Introduction
Manyetik Rezonans Görüntüleme (MRG) ve Bilgisayarlı Tomografi (BT) beyin lezyonlarının gerçek zamanlı analizinde kullanılan başlıca yöntemlerdir. Beyin tümörü farklılaşması genellikle ek boyama ve ileri immünohistokimyasal tekniklerle histopatolojiye dayanır. Dünya Sağlık Örgütü (WHO) tarafından 2016 yılında yayınlanan merkezi sinir beyin tümörleri ile ilgili güncellenen kılavuza göre, genetik testler bu tümörlerin farklılaşması ve sınıflandırılması için çok önemlidir1. Tümörlerin farklılaşması ve sınıflandırılması hekimlerin belirli bir tümör tipi için en etkili tedaviyi seçmelerine olanak sağlayarak hastanın yaşam beklentisini genişletir. Ne yazık ki, hastaları için optimum bir tedavi seçiminde hekimlere yardımcı olmak için bu tür gelişmiş yöntemlerin durumu rağmen, glioblastoma tanısı hastaların yaşam beklentisi (IV sınıf glioma) sadece yaklaşık 15-16 ay2. Söz konusu görüntüleme ve histolojik yöntemlerin tanı araçları olarak gelişmişliği ve doğruluğu nun artmasına rağmen, hekimlere tedavinin seyri ile ilgili kararlarda yardımcı olmak için tamamlayıcı bilgi sunabilen yeni tekniklere hala büyük ihtiyaç vardır. Son yıllarda, kitle spektrometresi dayalı birkaç yeni yaklaşımlar kanser intraoperatif analizi için önerilmiştir3,4. Katı faz mikroekstraksiyon potansiyeli (SPME), hızlı bir yerinde analiz aracı olarak burada sunulan yöntem, zaten çalışmalar da çeşitli gösterilmiştir5. Mevcut el yazması yöntemin klinik uygulamalarından birini, hedefsiz metabolomikve insan beyin tümörlerinin lipidomiklerini göstermektedir. Hedeflenmemiş araştırmalar potansiyel biyobelirteçlerin keşfinde önemli bir başlangıç noktası dır. Kurulduktan sonra, bu tür biyobelirteçler daha sonra yerinde enstrümantasyon ile birleştiğinde aynı teknolojiyi kullanarak tümörler arasında ayırt etmek için tanısal referanslar olarak kullanılabilir.
SPME, küçük miktarlarda ekstraksiyon fazı kullanılarak örnek matrislerden küçük molekülleri çıkaran denge tabanlı bir numune hazırlama tekniğidir. Cihazın SPME en geleneksel yapılandırma (prob), bir lif uygun bir çıkarma aşaması ile kaplanır ve sağlam bir destek yani immobilize, bir metal tel5,6. Biyouyumlu kaplamalar ve cihazlar (problar), örneğin homojenizasyon ve filtrasyon gibi numune ön işleme olmadan doğrudan karmaşık biyolojik matrislerden ekstraksiyon sağlar. Ekstraksiyon işlemi sayesinde, analitler çıkarma aşaması ve numune matrisi arasında ilk konsantrasyonlarıyla orantılı olarak bölümlenir. Eğer ekstraksiyon yeterince uzun yapılırsa, o zaman denge elde edilir. Dengede çıkarma mümkün olan en yüksek hassasiyet ve tekrarlanabilirliği sağlarken, ön denge ekstraksiyonu da mümkündür ve hatta bazı durumlarda, yerinde örneklemeyle ilgili zaman kısıtlamalarının (örn. işletme veya acil servisler) hızlı ekstraksiyonlar gerektirdiği, in vivo örnekleme de mümkündür. Belirli bir analitin ekstraksiyon zaman profili genellikle analitin fizyokimyasal özelliklerinden, örnekleniyor olan matristen, kullanılan sorbent türünden ve diğer bazı ekstraksiyon koşullarından etkilenir. Bunların ekstraksiyon kinetiğini yöneten faktörlerin bolluğu, metabolomik veya lipidomik gibi hedeflenmemiş analizler yapıldığında tüm bileşiklerin denge ekstraksiyonunun sağlanmasını neredeyse imkansız hale getirir. Yukarıda belirtilen nedenlerle, geçerli protokolün çıkarma süresi, bir yandan metabolitlerin tatmin edici hassasiyetini ve kapsamını, diğer yandan da yerinde kullanım için pratikliği sağlamak için rasgele olarak ayarlanmıştır.
Dokulardan numune alınmasında kullanılan probların çok küçük bir boyutu sadece minimum doku hasarına neden olurken, örnekleme işleminin kendisi herhangi bir doku değil, örneklenen bölgeden çok az miktarda küçük molekül tüketir; bu nedenle, aynı örnek daha rutin testler yani, histolojik veya genetik için kullanılabilir, aynı örnekten temel ve tamamlayıcı bilgilerin elde edilmesini sağlayan. Bu tür tamamlayıcı, kapsamlı veriler tümör biyolojisinin daha iyi anlaşılmasını sağlayacak ve yeni tedavi hedeflerinin keşfini kolaylaştıracak. Bu yöntemden yararlanmak, hedef biyobelirteçleri belirlerken yerinde intraoperatif tanı olasılığını daha da arttırmaktadır.
Aşağıda metabolomik ve lipidomik analizler ve veri işleme için beyin tümörlerinin yerinde örneklenmesi için protokoller sayılmaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hedeflenmemiş metabolomik ler ve lipidomikler tümör biyobelirteçlerinin belirlenmesine odaklanan çalışmalarda yaygın olarak kullanılmaktadır. Ancak, çoğu durumda, araştırmacılar hastalığın taranması için kullanılabilecek bileşikler arayın. Sonuç olarak, tercih edilen biyolojik örnekler kan veya idrar nispeten kolay erişim nedeniyle. Tümör dokusunun analizi esas olarak hastalığın arkasındaki mekanizmaları anlamak, farklı tümör tiplerini karakterize etmek vb. için yapılır. Tümör biyobelirteçlerinin yerinde analizi nadiren yapılır, çünkü bu tür uygulamalar kapsamlı numune hazırlama gerektirir. Alternatif olarak, belirli biyobelirteçlerin ön seçimi olmadan doku profillerinin gerçek zamanlı analizine dayalı stratejiler tıp camiasının dikkatini çekiyor3,4. Burada sunulan çözüm, bu tür yöntemlerle elde edilebilen bilgi türünü açıklayarak yerinde doku işlemeye başka bir bakış açısı sağlar.
Örnekleme, numune hazırlama ve çıkarma birleşimi, SPME’yi yerinde analiz için çok yararlı bir araç haline getirir. Ayrıca, örnekleme sırasında doku tüketiminin azlığı biyomarker analizi ve rutin testler (genotipleme, histolojik analiz) için aynı numunelerin daha fazla kullanılmasını sağlar ve bu nedenle standart test sonuçlarına yeni bilgiler ekler. Örnekleme cihazı çok basit bir tasarıma sahiptir, kullanımı çok kolaydır ve çıkarma işleminin kendisi için özel bir eğitim gerekmez. Ancak, güvenilir sonuçlar elde etmek, cihazların düzgün bir şekilde işlenmesinden çok daha fazlasını gerektirir. Denemeyi düzgün bir şekilde gerçekleştirmek için, çıkarma işlemini, örneğin doğasını anlamak ve verileri etkileyebilecek olası hataların farkında olmak gerekir.
Bu kanserli doku heterojenite dikkate almak önemlidir10; örneklenen tümörler nekroz, kalsifikasyon ve hipoksi geçiren parçalar içerebilir ve bu süreçlerin her biri elde edilen metabolom ve lipidom yansıtılır, böylece sonuçları etkileyen. Bu nedenle, uzamsal çözünürlük örnekleme kanserli doku farklı bölgelerinde çeşitli liflerin takılarak yapılması tavsiye edilir, ya da alternatif olarak, daha uzun bir kaplama böylece tümör hakkında ortalama bilgi elde etmek için tümörün tüm nüfuz etmek için kullanılması. Uzamsal çözünürlük örnekleme yöntemi uygulanıyorsa, lifler tek bir desorpsiyon çözücüye dönüştürülebilir; bu sadece tümör hakkında genel bilgi elde etmek için izin olmaz, ama aynı zamanda analiz duyarlılığını artırmak. Alternatif olarak, ayrı şişeler halinde bireysel liflerin desorpsiyon beyin tümörü iç çeşitliliği anlamaya soruşturma sağlayacak, hangi kanserli hücrelerden inşa çekirdek oluşur, ve dış bölge, hangi sağlıklı doku sınırıdır. Tümörün daha derin bölümleri genellikle daha fazla kanser ile ilgili süreçler tarafından zarar11. Ancak, araştırmacılar bu seçeneğin yöntem hassasiyetini ve saptanabilir bileşiklerin toplam sayısını tehlikeye attığını unutmamalıdır. Mevcut çalışmada 7 mm’lik bir kaplama kullanılmıştır; bu uzunluk çalışmada yer alan tümörlerin çeşitli boyutları için optimum olarak kabul edildi. Kaplamalar tümörleri deldi ve böylece özel olmayan çözünürlük sağladı, ancak örnek boyunca veri ortalaması. Seçilen protokolden bağımsız olarak, bireysel örneklemede kullanılan lif sayısı, kaplamanın uzunluğu, çıkarma süresi ve bu çalışmada belirtilen diğer tüm faktörler de dahil olmak üzere, tüm çalışma sırasında aynı protokolün izlenmesi önemlidir.
Analizin kalitesini kontrol etmek önemlidir. Havuzlanmış QC (protokoldeki 4.7 ve 7.7 adımlarını görün) hazırlanmalı ve tüm numune toplu iş lerinin çalışması sırasında alet kararlılığını izlemek için kullanılmalıdır. Boş denetimler (bkz. adım 2.8) daha sonra çözücülerden veya elyaf üretiminden kaynaklanan kirletici sinyalleri ortadan kaldırmak için bir “dışlama listesi” hazırlamak için kullanılabilir. Kontaminasyon riski gibi özel durumlarda, eldivenlerden, masalardan, cihazlardan veya kontaminasyon riski oluşturabilecek diğer yüzeylerden numune alınması gereklidir. Bu gibi durumlarda, lif hazırlama, çıkarma süresi ve desorpsiyon protokolleri örnekler için aynıdır.
Metabolomik ve lipidomik analizler tamamen bir organizmada veya organizmanın belirli bileşenlerinde görünen küçük moleküllere (1.500 Da’dan az) odaklanır, örneğin belirli organlar, dokular, sıvılar, hücreler, vb. Metabolomik ve lipidomik ler vücutta meydana gelen biyokimyasal değişikliklerin bir anlık görüntüsünü sunar lar ve kanser durumunda tümörün genomu, histolojisi ve malignitesi ile ilgili bilgileri bütünleştirirler. Bu omik bilimler proteinler veya genler12daha biyokimyasal merdivende daha yüksek olduğu gibi metabolitleri olarak fizyoloji ve fenotip arasında bir bağlantı oluşturmak. Kanserli tümörlerin metabolom ve lipidomlarını anlayarak, tüm omik bilimler arasında fenotipi keşfetmeye daha da yaklaşırız, çünkü bu çalışma dalları, canlı organizmaların çeşitli uyaranlara tepkisi olarak moleküllerin dinamik değişimleri hakkında daha derinlemesine bilgi sunar. Bu çalışmada da sunulduğu gibi, bir örneklemede elde edilen veriler kanser histolojisine, malignite derecesine karşılık gelir ve genom düzeyinde meydana gelen değişiklikleri yansıtır. Gliomas’ta, bu çalışmada ilgi kanser türü olarak, genomda gizli bilgiler özellikle önemlidir, kişiselleştirilmiş bir tedavi genetik testlerin sonuçlarına göre geliştirilmiştir. Özellikle mutasyonlar kemoterapi veya radyoterapi sonuçlarının prognostik belirteçleridir. Burada gösterildiği gibi, belirli bir mutasyonu yansıtan biyobelirteçlerin seçimi önerilen strateji ile mümkündür. Mutasyon belirteçleri, tümörün malignite derecesini gösteren ek tanımlayıcı tiplerin yanı sıra rutin tanı yöntemlerini desteklemek için de kullanılabilir.
Solid faz mikroekstraksiyon lifleri kullanımı ile ex vivo kimyasal biyopsi intraoperatif tanı yönteminin uygulanmasında ilk adımdır. Bu yöntem, uygun Etik Kurullardan izin almak için in vivo örnekleme için kolayca benimsenebilir. Bu gibi durumlarda, Örneklemenin yapılacağı hastanenin kabul edilen sterilizasyon işlemlerine göre SPME cihazlarının sterilizasyonu, yani otoklavlama veya etilen oksit sterilizasyonu yapılmalıdır. Önceden şartlandırılmış ve sterilize edilmiş lifler sterilizasyon son kullanma tarihi ile etiketlenmiş mühürlü ambalajlarda saklanmalıdır. Liflerin yüzey aktif madde kullanımı ile temizlenmemesi gerektiğine dikkat etmek önemlidir. Böyle bir yordam sorbent bileşiminde spesifik olmayan değişikliklere neden olabilir, böylece analit lerin çıkarılmasını etkileyebilir. Burada açıklanan çalışmalarda, 30 dk çıkarma süresi kullanılmıştır, ancak diğer raporlar daha kısa süreler vivo çalışmalarda tatmin edici sonuçlar verebilir doğrulamak13. Huq ve ark. analit denge süresi basit matrisler14daha karmaşık bir matris olarak, dokuda daha hızlı elde olduğunu gösterdi. Ancak, elde edilen sonuçların tekrarlanabilirliği daha kısa ekstraksiyon süreleri altında tehlikeye olabilir, zira ön denge koşullarında daha fazla analit çıkarılacaktır; bu nedenle, kesin zaman kontrolü uygulanmalıdır.
Bu çalışmanın bir parçası olarak sömürülen her iki omik bilim biyomarker keşif araçları olarak mükemmel bir potansiyele sahiptir. Biyobelirteçler seçildikten veya kemometrik bir model oluşturulduktan sonra, bu çalışmada tanımlanan SPME yaklaşımı gibi yerinde araştırmalar için geçerli yöntemlerle hedef metabolitlerin belirlenmesine dayalı tıbbi tanılar rutin tanılamanın bir parçası olarak geliştirilebilir ve uygulanabilir.
Bu el yazmasında önerilen protokol, potansiyel biyobelirteçlerin taranması için katı faz mikroekstraksiyonu kullanılarak kanser dokusunun hedeflenmemiş metabolomik ve lipidomik analizlerinin nasıl yapılacağını açıklamaktadır. Temsili bileşiklerin çıkarılmasını, tümörlerin farklılaşmasını ve belirli bir kanseri karakterize eden ayrımcı bileşiklerin belirlenmesini sağlamak için tasarlanmıştır. Bu makalede açıklanan SPME ile yapılan hedefsiz analizler, numunede bulunan tüm bileşiklerin taranması na gerek kalmadan seçilen bir bileşik panelinin belirlenebileceği hızlı intraoperatif tanının geliştirilmesinde bir başlangıç noktasıdır. Hızlı tanı sonuçları nın yararına, yerinde çıkarma için kullanılan SPME probları doğrudan hastane tesisinde bulunan analitik enstrümantasyonla birleşebilir. Kromatografi içermeyen analizin ardından minimum numune hazırlama ile yapılan basit ekstraksiyonlar, ilaçtakibiiçin açıklandığı üzere, genel süreyi saatten birkaç dakikaya önemli ölçüde kısaltır.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Çalışma, Ulusal Bilim Merkezi’nden Grant Harmonia 2015/18/M/ST4/00059 tarafından desteklenmiştir. Yazarlar MilliporeSigma, Merck KGaA, Darmstadt, Almanya, bu çalışmada kullanılan SPME cihazları sağlamak için bir iş kabul etmek istiyorum. Merck’in yaşam bilimi işi ABD ve Kanada’da MilliporeSigma olarak faaliyet göstermektedir. Ayrıca, yazarlar Q-Exactive Focus orbitrap kütle spektrometresi erişim için Thermo Fisher Bilimsel teşekkür etmek istiyorum.
Yazarların katkıları: JB: numune hazırlama ve LC-MS parametrelerinin optimizasyonu, SPME-LC-MS deneylerinin performansı, veri analizi, istatistiksel analiz ve veri yorumu ve lipidomik kısmıyla ilgili el yazması hazırlama; PZG: hastanedeki numunelerin çoğunun koordinasyonu ve performansı, numune alma ve numune hazırlama parametrelerinin optimizasyonu, SPME-LC-MS deneylerinin performansı, veri analizi, istatistiksel analiz ve veri yorumu, metabolomik kısmıyla ilgili el yazması hazırlama; MG – numune hazırlama, LC-MS yöntemi ve lipidomik kısmı ile ilgili veri analizi optimizasyonu nda yardım; KG: SPME örneklemelerinin birlikte ifası ve örnekleme ve numune hazırlama optimizasyonu, metabolomik kısmıile ilgili SPME-LC-MS analizi; KC: hastanede çeşitli SPME örneklemelerinin gerçekleştirilmesi, örneklemenin optimizasyonunda yardım, metabolomik kısmıyla ilgili numune hazırlama ve veri analizi; KJ: hastanede çeşitli SPME örneklerinin performansı, lipidomik analizinde yardım; DP: cerrahi prosedürlerin gerçekliği, hastaların işe alınması; JF: cerrahi prosedürlerin performansı, hastaların işe alınması; MH: cerrahi prosedürlerin gerçekliği, araştırmanın klinik kısmının koordinasyonu; BB: konsept, projenin koordinasyon denetimi ve el yazması hazırlama, çeşitli örneklerin performansı
Materials
| acetic acid | Honeywell | 49199 | Mobile phase additive, LCMS grade |
| acetonitrile | Honeywell | 34967 | HPLC solvent, LCMS grade |
| ammonium acetate | Honeywell | 14267 | Mobile phase additive, LCMS grade |
| BenchMixer MultiTube Vortexer | Benchmark Scientific | BV1010* | Vortex mixer |
| caps | Agilent | 5183-2076 | Blue scrw tp,pre-slit PTFE/Si septa |
| Compound Discoverer 2.1 | Thermo Scientific | software for data processing | |
| Discovery HS F5 Supelguar Cartridge 2 cm × 2.1 mm, 3 μm | Supelco | 567571-U | Guard Column |
| Discovery HS F5, 2.1 mm x 100 mm, 3 μm | Merck | 567502-U | HPLC Column |
| formic acid | Honeywell | 56302 | Mobile phase additive, LCMS grade |
| glass vial inserts 250ul , deactivated | Agilent | 5181-8872 | |
| glass vial inserts 350ul | Agilent | 5188-5321 | |
| glass vials 1.5ml | Agilent | 5183-2030 | |
| glass vials, 2 mL (amber, deactivated) | Agilent | 5183-2072 | |
| glass vials, 2mL | Agilent | 5182-0715 | |
| HILIC Luna 3 μm, 200A, 100 x 2.0 mm | Shim-Pol | PHX-00D-4449-B0 | HPLC Column |
| isopropanol | Honeywell | 34965 | HPLC solvent, LCMS grade |
| LipidSearch 4.1 | Thermo Scientific | software for data processing | |
| Metaboanalyst | Xia Lab @ McGill | online software for statistical analysis (Chong, J., Wishart, D.S. and Xia, J. (2019) Using MetaboAnalyst 4.0 for Comprehensive and Integrative Metabolomics Data Analysis. Current Protocols in Bioinformatics 68, e86 ) | |
| methanol | Honeywell | 34966 | HPLC solvent, LCMS grade |
| Pierce LTQ Velos ESI Positive Ion Calibration Solution | Thermo Scientific | 88323 | |
| Pierce Negative Ion Calibration Solution | Thermo Scientific | 88324 | |
| Q Exactive Focus hybrid quadrupole-Orbitrap MS | Thermo Scientific | 726049 | Mass Spectrometer |
| SecurityGuard cartridge for HILIC, 4 mm × 2.0 mm | Phenomenex | KJ0-4282 | Guard Column |
| SeQuant ZIC-cHILIC 3µm,100Å 100 x 2.1 mm | Merck | 1506570001 | HPLC Column |
| SeQuant ZIC-HILIC Guard Kit 20 x 2.1 mm | Supelco | 1504360001 | Guard column |
| SPME LC fiber probes, C18 | Supelco | custom order | comercial probes: 57281-U; probes used in the experiment were not needle assembled and were precut to the length described in the protocol |
| SPME LC fiber probes, mixed Mode | Supelco | custom order | |
| UltiMate 3000 HPLC systems | Thermo Scientific | 5200.0345 | HPLC system |
| water | Merck | 1153331000 | HPLC solvent, LCMS grade |
| XSelect CSH C18 3.5μm 2.1x75mm | Waters | 186005644 | HPLC Column |
| XSelect CSH C18 VanGuard Cartridge, 3.5 µm, 3.9×5 mm | Waters | 186007813 | Column cartidge |
Referencias
- Louis, D. N., et al. The 2016 World Health Organization Classification of Tumors of the Central Nervous System: a summary. Acta Neuropathologica. 131 (6), 803-820 (2016).
- Bi, W. L., Beroukhim, R. Beating the odds: extreme long-term survival with glioblastoma. Neuro Oncology. 16 (9), 1159-1160 (2014).
- Ifa, D. R., Eberlin, L. S. Ambient Ionization Mass Spectrometry for Cancer Diagnosis and Surgical Margin Evaluation. Clinical Chemistry. 62, 111-123 (2016).
- Alexander, J., et al. A novel methodology for in vivo endoscopic phenotyping of colorectal cancer based on real-time analysis of the mucosal lipidome: a prospective observational study of the iKnife. Surgical Endoscopy. 31 (3), 1361-1370 (2017).
- Reyes-Garcés, N., et al. Advances in Solid Phase Microextraction and Perspective on Future Directions. Analytical Chemistry. 90, 302-360 (2018).
- Pawliszyn, J. . Handbook of Solid Phase Microextraction. , (2009).
- Vuckovic, D., Pawliszyn, J. Systematic Evaluation of Solid-Phase Microextraction Coatings for Untargeted Metabolomic Profiling of Biological Fluids by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 83, 1944-1954 (2011).
- Cajka, T., Fiehn, O. Comprehensive analysis of lipids in biological systems by liquid chromatography-mass spectrometry. Trends in Analytical Chemistry. 61, 192-206 (2014).
- Goryńska, P. Z., et al. A new strategy for brain tumour metabolomic analysis. Medical Research Journal. 3 (1), 15-22 (2018).
- Meacham, C. E., Morrison, S. J. Tumour heterogeneity and cancer cell plasticity. Nature. 501 (7467), 328-337 (2013).
- Fernandes, M., Rosel, D., Brábek, J. Translation in solid cancer: are size-based response criteria an anachronism. Clinical Translational Oncology. 17 (1), 1-10 (2015).
- Lämmerhofer, M., Weckwerth, W. . Metabolomics in Practice: Successful Strategies to Generate and Analyze Metabolic Data. , (2013).
- Lendor, S., et al. Solid Phase Microextraction- Based Miniaturized Probe and Protocol for Extraction of Neurotransmitters from Brains in Vivo. Analytical Chemistry. 91 (7), 4896-4905 (2019).
- Huq, M., Tascon, M., Nazdrajic, E., Roszkowska, A., Pawliszyn, J. Measurement of Free Drug Concentration from Biological Tissue by Solid-Phase Microextraction: In Silico and Experimental Study. Analytical Chemistry. 91 (12), 7719-7728 (2019).
- Looby, N., et al. Solid phase microextraction coupled to mass spectrometry via a microfluidic open interface for rapid therapeutic drug monitoring. Analyst. 144, 3721-3728 (2019).
