Manuskriptet presenterer prøvetaking av menneskelige hjernesvulster med solid fase mikroektraksjon etterfulgt av deres biokjemiske profilering mot oppdagelsen av biomarkører.
Til tross for ulike verktøy som er tilgjengelige for kreftdiagnose og klassifisering, er metoder som muliggjør rask og enkel karakterisering av svulster fortsatt i nød. I de senere årene har massespektrometri blitt en metode for valg for ikke-målrettet profilering av diskriminerende sammensatt som potensielle biomarkører av en sykdom. Biofluider anses generelt som å foretrekke matriser gitt deres tilgjengelighet og enklere prøvebehandling, mens direkte vevprofilering gir mer selektiv informasjon om en gitt kreft. Fremstilling av vev for analysen via tradisjonelle metoder er mye mer komplisert og tidkrevende, og derfor ikke egnet for rask analyse på stedet. Det nåværende arbeidet presenterer en protokoll som kombinerer prøveforberedelse og ekstraksjon av små molekyler på stedet, umiddelbart etter tumorreseksjon. Prøvetakingsenheten, som er av størrelsen på en akupunkturnål, kan settes direkte inn i vevet og deretter transporteres til det nærliggende laboratoriet for instrumental analyse. Resultatene av metabolomics og lipidomics analyser viser evnen til tilnærmingen for etablering av fenotyper av svulster knyttet til den histologiske opprinnelsen til svulsten, malignitet, og genetiske mutasjoner, samt for valg av diskriminerende forbindelser eller potensielle biomarkører. Den ikke-destruktive karakteren av teknikken tillater etterfølgende ytelse av rutinemessig brukte tester, for eksempel histologiske tester, på de samme prøvene som brukes til SPME-analyse, og dermed muliggjør oppnåelse av mer omfattende informasjon for å støtte personlig diagnostikk.
Magnetic Resonance Imaging (MR) og Computertomography (CT) er de viktigste metodene som brukes til sanntidsanalyse av hjernelesjoner. Hjernesvulst differensiering er generelt basert på histopatologi med ekstra farging og avanserte immunohistokjemiske teknikker. Ifølge oppdatert veiledning om sentralnerve hjernesvulster utstedt av Verdens helseorganisasjon (WHO) i 2016, genetiske tester er avgjørende for differensiering og klassifisering av disse svulstene1. Differensiering og klassifisering av svulster tillater leger å velge den mest effektive behandlingen for en gitt type svulst og dermed utvide pasientens forventede levetid. Dessverre, til tross for tilgjengeligheten av slike avanserte metoder for å hjelpe leger i å velge en optimal terapi for sine pasienter, er forventet levetid for pasienter diagnostisert med glioblastom (IV-klasse gliom) bare ca 15-16 måneder2. Selv med raffinement og økt nøyaktighet av nevnte avbildning og histologiske metoder som diagnostiske verktøy, er det fortsatt et stort behov for nye teknikker som er i stand til å tilby komplementær informasjon for å hjelpe leger i beslutninger om behandlingsforløpet. I løpet av de siste årene har flere nye tilnærminger basert på massespektrometri blitt foreslått for intraoperativ analyse av kreft3,4. Potensialet for solid fase mikroektraksjon (SPME), metoden som presenteres heri, som et raskt analyseverktøy på stedet, er allerede vist i en rekke studier5. Det nåværende manuskriptet viser en av metodens kliniske anvendelser, umålrettede metabolomikk og lipidomikk av menneskelige hjernesvulster. Umålrettede undersøkelser presenterer et viktig utgangspunkt i oppdagelsen av potensielle biomarkører. Når etablert, slike biomarkører kan deretter brukes som diagnostiske referanser for å skille mellom svulster ved hjelp av samme teknologi koblet til på stedet instrumentering.
SPME er en likevektsbasert prøveforberedelsesteknikk som trekker ut små molekyler fra prøvematriser ved bruk av små mengder ekstraksjonsfase. I SPME mest tradisjonelle konfigurasjon av enheten (sonde), er en fiber belagt med en passende ekstraksjonsfase og immobilisert på en solid støtte, det vil vil at enmetalltråd 5,6. Biokompatible belegg og enheter (prober) muliggjør ekstraksjon direkte fra komplekse biologiske matriser uten prøvebehandling, for eksempel homogenisering og filtrering. Gjennom ekstraksjonsprosessen partisjoneres analyser mellom ekstraksjonsfasen og prøvematrisen i forhold til deres opprinnelige konsentrasjoner. Hvis utvinning utføres lenge nok, oppnås likevekt. Mens ekstraksjon ved likevekt gir høyest mulig følsomhet og reproduserbarhet, er pre-likevektsutvinning også mulig og til og med å foretrekke i noen tilfeller, det vil si in vivo-prøvetaking, hvor tidsbegrensninger knyttet til prøvetakingen på stedet (f.eks. drifts- eller beredskapsrom) nødvendiggjør raske ekstraksjoner. Ekstraksjonstidsprofilen til en gitt analytt påvirkes vanligvis av de fysikalske egenskapene til analytten, matrisen som samples, typen sorbent som brukes, og flere andre ekstraksjonsforhold. Mengden av faktorer som styrer deres ekstraksjon kinetikk gjør det praktisk talt umulig å sikre likevekt utvinning av alle forbindelser når untargeted analyser som metabolomics eller lipidomics utføres. Av ovennevnte grunner ble utvinningstiden til den nåværende protokollen satt vilkårlig for å sikre tilfredsstillende følsomhet og dekning av metabolitter på den ene siden, og praktisk for bruk på stedet på den andre.
Det bør understrekes at den svært lille størrelsen på sonder som brukes til ekstraksjon av prøve fra vev, bare forårsaker minimal vevsskade mens prøvetakingsprosedyren i seg selv ikke bruker noe vev, men svært små mengder små molekyler fra det samplede området; Derfor kan den samme prøven brukes videre til rutinemessige tester, det vil si histologisk eller genetisk, slik at oppnåelse av essensiell og komplementær informasjon fra samme prøve. Slike komplementære, omfattende data ville muliggjøre en bedre forståelse av tumorbiologi, forhåpentligvis tilrettelegge oppdagelsen av nye behandlingsmål. Utnyttelse av denne metoden øker ytterligere muligheten for intraoperativ diagnostikk på stedet ved fastsettelse av målbiomarkører.
Nedenfor presenterer vi protokoller for prøvetaking av hjernesvulster på stedet for metabolomikk og lipidomikkanalyser og databehandling.
Untargeted metabolomics og lipidomics er ofte brukt i studier fokusert på å identifisere tumor biomarkører. Men i de fleste tilfeller ser forskerne etter forbindelser som kan brukes til screening av sykdommen. Følgelig er de foretrukne biologiske prøvene blod eller urin på grunn av deres relativt enkel tilgang. Analyse av tumorvev utføres hovedsakelig for å forstå mekanismene bak sykdommen, karakterisere ulike tumortyper, etc. Analyse på stedet av tumorbiomarkører utføres sjelden, da slike applikasjoner krever omfattende prøveforberedelse. Alternativt tjener strategier basert på sanntidsanalyse av vevsprofiler uten forhåndsvalg av spesifikke biomarkører oppmerksomheten til det medisinske samfunnet3,4. Løsningen som presenteres her gir et annet perspektiv på vevsbehandling på stedet ved å avsløre hvilken type informasjon som kan oppnås via slike metoder.
Kombinasjonen av prøvetaking, prøveklargjøring og ekstraksjon gjør SPME et svært nyttig verktøy for analyse på stedet. Videre, mangel på vevforbruk under prøvetaking muliggjør videre bruk av de samme prøvene for biomarkør analyse og rutinemessige tester (genotyping, histologisk analyse), derfor legge til ny informasjon til resultatene av standard testing. Prøvetakingsenheten har en veldig enkel design, driften er veldig enkel, og ingen spesiell opplæring er nødvendig for å utføre selve utvinningen. Men å oppnå pålitelige resultater krever mye mer enn bare riktig håndtering av enheter. For å utføre eksperimentet riktig, må man forstå ekstraksjonsprosessen, arten av prøven, og være klar over potensielle feil som kan påvirke dataene.
Det er viktig å vurdere heterogeniteten av kreftvev10; samplede svulster kan inneholde deler som gjennomgår nekrose, forkalkning og hypoksi, og hver av disse prosessene vil bli reflektert i metabolom og lipidome oppnådd, og dermed påvirke resultatene. Derfor anbefales det at romlig oppløsning prøvetaking utføres ved innsetting av flere fibre i forskjellige deler av kreftvevet, eller alternativt at et lengre belegg brukes til å trenge inn i hele svulsten for å få gjennomsnittlig informasjon om svulsten. Hvis den romlige oppløsningsprøvetakingsmetoden utføres, kan fibrene alle desorberes til ett desorpsjonsløsningsmiddel; Dette ville ikke bare tillate oppnåelse av generell informasjon om svulsten, men også øke følsomheten til analysen. Alternativt vil desorpsjon av individuelle fibre i separate hetteglass gjøre det mulig for undersøkelser å finne ut det indre mangfoldet av hjernesvulsten, som består av kjernen bygget av kreftceller, og den ytre sonen, som er grensen til sunt vev. Dypere deler av svulsten er vanligvis mer skadet av prosessene knyttet til kreft11. Men, etterforskere må huske på at dette alternativet kompromisser metoden følsomhet og det totale antall påvisbare forbindelser. I det nåværende arbeidet ble det brukt et 7 mm belegg; denne lengden ble ansett som optimal for ulike størrelser av svulster inkludert i studien. Belegget trengte inn i svulstene, og ga dermed ikke-spesiell oppløsning, men gjennomsnittlig data på tvers av prøven. Uavhengig av protokollen som er valgt, er det viktig at den samme protokollen følges under hele studien, inkludert antall fibre som brukes til individuell prøvetaking, lengden på belegget, ekstraksjonstiden og alle andre faktorer som er avgrenset i dette arbeidet.
Det er viktig å kontrollere kvaliteten på analysen. Den samlede QC (se trinn 4.7 og 7.7 i protokollen) bør være forberedt og brukes til overvåking instrumentstabilitet under kjøring av hele prøvegruppen. De tomme kontrollene (se trinn 2.8) kan senere brukes til å utarbeide en “ekskluderingsliste” for å eliminere signaler om forurensninger som stammer fra løsemidler eller fiberproduksjon. Ved spesielle anledninger, for eksempel fare for forurensning, er det nødvendig å utføre prøvetaking fra hansker, bord, apparater eller andre overflater som kan utgjøre en forurensningsrisiko. I slike tilfeller er fiberforberedelse, utvinningstid og desorpsjonsprotokoller de samme som for prøvene.
Metabolomiske og lipidomiske analyser er fokusert utelukkende på små molekyler (mindre enn 1500 Da) som vises i en organisme eller spesifikke komponenter i organismen, for eksempel spesifikke organer, vev, væsker, celler, etc. Metabolomiske og lipidomikk gir et øyeblikksbilde av biokjemiske endringer som forekommer i kroppen, og når det gjelder kreft, integrerer de informasjon relatert til genomet, histologien og maligniteten av svulsten. Disse omics vitenskaper skape en sammenheng mellom fysiologi og fenotype som metabolitter er høyere opp i biokjemisk stigen enn proteiner ellergener 12. Ved å forstå metabolom og lipidome av kreftsvulster, kommer vi nærmere å oppdage fenotypen blant alle -omics vitenskaper som disse grenene av studien tilbyr mer inngående kunnskap om dynamiske endringer av molekyler som et svar på levende organismer til ulike stimuli. Som presentert i dette arbeidet, tilsvarer dataene som er oppnådd i ett utvalg, kreftens histologi, dens grad av malignitet, og det gjenspeiler endringer som skjer på genomnivå. I gliomer, som den type kreft av interesse i denne studien, er informasjonen skjult i genomet spesielt viktig, da en personlig behandling utvikles basert på resultatene av genetiske tester. Spesielle mutasjoner er prognostiske markører for utfallet av kjemo- eller strålebehandling. Som demonstrert her, er valg av biomarkører som gjenspeiler en gitt mutasjon mulig med den foreslåtte strategien. Mutasjonsmarkører, samt flere beskrivelsestyper som de som indikerer graden av malignitet av svulsten, kan også brukes til å støtte rutinemessige diagnostiske metoder.
Ex vivo kjemisk biopsi ved bruk av solid fase mikroektraksjonsfibre er det første trinnet i anvendelsen av metoden til intraoperativ diagnostikk. Metoden kan enkelt vedtas for in vivo prøvetaking i påvente av tillatelse fra aktuelle etiske styrene. I slike tilfeller må sterilisering av SPME-enheter utføres i henhold til de aksepterte steriliseringsprosedyrene på sykehuset der prøvetaking skal utføres, det vil si autoklavering eller etylenoksidsterilisering. De pre-conditioned og steriliserte fibrene må oppbevares i forseglede pakker merket med en sterilisering utløpsdato. Det er viktig å merke seg at fibre ikke bør rengjøres ved bruk av overflateaktive stoffer. En slik prosedyre kan forårsake uspesifiserte endringer i sorbent sammensetning, og dermed påvirke utvinning av analytter. I studiene som er beskrevet her, ble det brukt en 30 min ekstraksjonsperiode, men andre rapporter bekrefter at kortere tider kan gi tilfredsstillende resultater i in vivo-studier 13. Huq et al. viste at analytisk likevektstid oppnås raskere i vev, som en kompleks matrise, enn i enkle matriser14. Reproduserbarheten av de oppnådde resultatene kan imidlertid kompromitteres under kortere ekstraksjonsperioder etter hvert som flere analytter vil bli ekstrahert under pre-likevektsforhold; Derfor må nøyaktig tidskontroll implementeres.
Begge omics vitenskaper utnyttet som en del av dette arbeidet har utmerket potensial som biomarkør oppdagelse verktøy. Når biomarkører er valgt eller en kjemometrisk modell er etablert, kan medisinsk diagnostikk basert på bestemmelse av målmetabolitter via metoder som gjelder for undersøkelser på stedet, for eksempel SPME-tilnærmingen som er beskrevet i dette arbeidet, utvikles og implementeres som en del av rutinemessig diagnostikk.
Protokollen som foreslås i det nåværende manuskriptet beskriver hvordan man utfører ikke-målrettede metabolomiske og lipidomiske analyser av kreftvev ved hjelp av solid fasemikrokstraksjon for screening av potensielle biomarkører. Den er utformet for å muliggjøre utvinning av representative forbindelser, differensiering av svulster, og identifisering av diskriminerende forbindelser som karakteriserer en gitt kreft det vil si potensielle biomarkører. De ikke-målrettede analysene med SPME beskrevet i denne artikkelen representerer et utgangspunkt i utviklingen av rask intraoperativ diagnostikk, hvor et valgt panel av forbindelser kan bestemmes uten nødvendighet for screening av alle forbindelser som finnes i prøven. Av hensyn til raske diagnostiske resultater kan SPME-sonder som brukes til ekstraksjon på stedet, kobles direkte til analytisk instrumentering i sykehusanlegget. Enkle ekstraksjoner utført med minimum prøveforberedelse etterfulgt av kromatografifri analyse vil betydelig forkorte total tid fra timer til noen få minutter, som allerede beskrevet for narkotikaovervåking15.
The authors have nothing to disclose.
Studien ble støttet av grant Harmonia 2015/18/M/ST4/00059 fra National Science Centre. Forfatterne ønsker å anerkjenne MilliporeSigma, en bedrift av Merck KGaA, Darmstadt, Tyskland, for å gi SPME-enhetene som brukes i dette arbeidet. Life Science-virksomheten til Merck opererer som MilliporeSigma i USA og Canada. Også forfatterne ønsker å takke Thermo Fisher Scientific for tilgang til Q-Exactive Focus orbitrap massespektrometer.
Forfatternes bidrag: JB: optimalisering av prøveforberedelse og LC-MS-parametere, ytelse av SPME-LC-MS-eksperimenter, dataanalyse, statistisk analyse og datatolkning og manuskriptforberedelse relatert til lipidomikkdel; PZG: koordinering og ytelse av de fleste prøvetakinger på sykehus, optimalisering av prøvetakings- og prøveforberedelsesparametere, utførelse av SPME-LC-MS-eksperimenter, dataanalyse, statistisk analyse og datatolkning, manuskriptforberedelse relatert til metabolomikkdel; MG – hjelp til optimalisering av prøveforberedelse, LC-MS-metode og dataanalyse relatert til lipidomikk del; KG: co-ytelse av SPME prøvetakinger og optimalisering av prøvetaking og prøve forberedelse, SPME-LC-MS analyse knyttet til metabolomics del; KC: ytelse av flere SPME-prøvetakinger på sykehus, assistanse i optimalisering av prøvetaking, prøveklargjøring og dataanalyse relatert til metabolomikkdel; KJ: ytelse av flere SPME prøvetakinger på sykehus, hjelp i lipidomics analyse; DP: utførelsen av kirurgiske prosedyrer, rekruttering av pasientene; JF: utførelsen av kirurgiske prosedyrer, rekruttering av pasientene; MH: utførelsen av kirurgiske prosedyrer, koordinering av klinisk del av forskningen; BB: konsept, koordinering tilsyn av prosjektet og manuskript forberedelse, utførelse av flere prøvetakinger
acetic acid | Honeywell | 49199 | Mobile phase additive, LCMS grade |
acetonitrile | Honeywell | 34967 | HPLC solvent, LCMS grade |
ammonium acetate | Honeywell | 14267 | Mobile phase additive, LCMS grade |
BenchMixer MultiTube Vortexer | Benchmark Scientific | BV1010* | Vortex mixer |
caps | Agilent | 5183-2076 | Blue scrw tp,pre-slit PTFE/Si septa |
Compound Discoverer 2.1 | Thermo Scientific | software for data processing | |
Discovery HS F5 Supelguar Cartridge 2 cm × 2.1 mm, 3 μm | Supelco | 567571-U | Guard Column |
Discovery HS F5, 2.1 mm x 100 mm, 3 μm | Merck | 567502-U | HPLC Column |
formic acid | Honeywell | 56302 | Mobile phase additive, LCMS grade |
glass vial inserts 250ul , deactivated | Agilent | 5181-8872 | |
glass vial inserts 350ul | Agilent | 5188-5321 | |
glass vials 1.5ml | Agilent | 5183-2030 | |
glass vials, 2 mL (amber, deactivated) | Agilent | 5183-2072 | |
glass vials, 2mL | Agilent | 5182-0715 | |
HILIC Luna 3 μm, 200A, 100 x 2.0 mm | Shim-Pol | PHX-00D-4449-B0 | HPLC Column |
isopropanol | Honeywell | 34965 | HPLC solvent, LCMS grade |
LipidSearch 4.1 | Thermo Scientific | software for data processing | |
Metaboanalyst | Xia Lab @ McGill | online software for statistical analysis (Chong, J., Wishart, D.S. and Xia, J. (2019) Using MetaboAnalyst 4.0 for Comprehensive and Integrative Metabolomics Data Analysis. Current Protocols in Bioinformatics 68, e86 ) | |
methanol | Honeywell | 34966 | HPLC solvent, LCMS grade |
Pierce LTQ Velos ESI Positive Ion Calibration Solution | Thermo Scientific | 88323 | |
Pierce Negative Ion Calibration Solution | Thermo Scientific | 88324 | |
Q Exactive Focus hybrid quadrupole-Orbitrap MS | Thermo Scientific | 726049 | Mass Spectrometer |
SecurityGuard cartridge for HILIC, 4 mm × 2.0 mm | Phenomenex | KJ0-4282 | Guard Column |
SeQuant ZIC-cHILIC 3µm,100Å 100 x 2.1 mm | Merck | 1506570001 | HPLC Column |
SeQuant ZIC-HILIC Guard Kit 20 x 2.1 mm | Supelco | 1504360001 | Guard column |
SPME LC fiber probes, C18 | Supelco | custom order | comercial probes: 57281-U; probes used in the experiment were not needle assembled and were precut to the length described in the protocol |
SPME LC fiber probes, mixed Mode | Supelco | custom order | |
UltiMate 3000 HPLC systems | Thermo Scientific | 5200.0345 | HPLC system |
water | Merck | 1153331000 | HPLC solvent, LCMS grade |
XSelect CSH C18 3.5μm 2.1x75mm | Waters | 186005644 | HPLC Column |
XSelect CSH C18 VanGuard Cartridge, 3.5 µm, 3.9×5 mm | Waters | 186007813 | Column cartidge |