Manuskriptet præsenterer på stedet prøveudtagning af menneskelige hjernetumorer med solid fase mikroudtræk efterfulgt af deres biokemiske profilering mod opdagelsen af biomarkører.
På trods af de mange forskellige værktøjer til rådighed for kræft diagnose og klassificering, metoder, der muliggør hurtig og enkel karakterisering af tumorer er stadig i nød. I de senere år er massespektrometri blevet en metode til valg for ikke-målrettet profilering af diskriminerende sammensatte som potentielle biomarkører for en sygdom. Biofluider anses generelt for at foretrække matricer på grund af deres tilgængelighed og lettere prøvebehandling, mens direkte vævsprofilering giver mere selektive oplysninger om en given kræftform. Fremstilling af væv til analyse ved hjælp af traditionelle metoder er langt mere kompleks og tidskrævende og derfor ikke egnet til hurtig analyse på stedet. Det nuværende arbejde præsenterer en protokol, der kombinerer prøveforberedelse og udvinding af små molekyler på stedet, umiddelbart efter tumorresektion. Prøvetagningsanordningen, som er på størrelse med en akupunkturnål, kan indsættes direkte i vævet og derefter transporteres til det nærliggende laboratorium til instrumental analyse. Resultaterne af metabolomics og lipidomics analyser viser evnen af tilgangen til etablering af fænotyper af tumorer relateret til den histologiske oprindelse af tumoren, malignitet, og genetiske mutationer, samt for udvælgelse af diskriminerende forbindelser eller potentielle biomarkører. Teknikkens ikke-destruktive karakter gør det muligt efterfølgende at udføre rutinemæssigt anvendte test, f.eks.
Magnetic Resonance Imaging (MR) og Computertomografi (CT) er de vigtigste metoder, der anvendes til realtidsanalyse af hjernelæsioner. Brain tumor differentiering er generelt baseret på histopatologi med yderligere farvning og avancerede immunhisemiske teknikker. Ifølge den opdaterede vejledning om centralnerve hjernetumorer udstedt af Verdenssundhedsorganisationen (WHO) i 2016, genetiske tests er afgørende for differentiering og klassificering af disse tumorer1. Differentiering og klassificering af tumorer giver læger mulighed for at vælge den mest effektive behandling for en given type tumor og dermed udvide den forventede levetid for patienten. Desværre, på trods af tilgængeligheden af sådanne avancerede metoder til at hjælpe læger med at vælge en optimal behandling for deres patienter, den forventede levetid for patienter diagnosticeret med glioblastom (IV grade gliom) er kun omkring 15-16 måneder2. Selv med raffinement og øget nøjagtighed af de nævnte billeddannelse og histologiske metoder som diagnostiske værktøjer, er der stadig et stort behov for nye teknikker i stand til at tilbyde supplerende oplysninger til støtte læger i beslutninger om behandlingsforløb. I løbet af de seneste år er der foreslået flere nye tilgange baseret på massespektrometri til intraoperativ analyse af kræft3,4. Potentialet i fast fase mikroekstræk (SPME), den metode, der præsenteres heri, som en hurtig on-site analyse værktøj, er allerede blevet påvist i en række undersøgelser5. Det nuværende manuskript viser en af de kliniske anvendelser af metoden, ikke-målrettede metabolomics og lipidomics af menneskelige hjernetumorer. Ikke-målrettede undersøgelser udgør et vigtigt udgangspunkt for opdagelsen af potentielle biomarkører. Når det er etableret, sådanne biomarkører kan derefter bruges som diagnostiske referencer til at differentiere blandt tumorer ved hjælp af den samme teknologi koblet til on-site instrumentering.
SPME er en ligevægtsbaseret prøveforberedelsesteknik, der udtrækker små molekyler fra prøvemaskræces med anvendelse af små mængder ekstraktionsfase. I SPME’s mest traditionelle konfiguration af enheden (sonde), en fiber er belagt med en passende ekstraktion fase og immobiliseret på en solid støtte, dvs en metaltråd5,6. Biokomplicible belægninger og anordninger (sonder) muliggør ekstraktion direkte fra komplekse biologiske matricer uden prøveforbehandling, f.eks. Gennem ekstraktionsprocessen opdeles analytter mellem ekstraktionsfasen og prøvematrixen i forhold til deres oprindelige koncentrationer. Hvis ekstraktionen udføres længe nok, opnås ligevægten. Mens udvinding ved ligevægt giver den højest mulige følsomhed og reproducerbarhed, er det også muligt at foretage forligevægtsekstraktion og endda i nogle tilfælde at foretrække, dvs. Ekstraktionstidsprofilen for en given analysand påvirkes generelt af analysandens fysisk-kemiske egenskaber, den matrix, der udtages prøver af, den anvendte type sorbent og flere andre ekstraktionsbetingelser. Den overflod af faktorer, der styrer deres ekstraktion kinetik gør det praktisk umuligt at sikre ligevægt ekstraktion af alle forbindelser, når ikke-målrettede analyser såsom metabolomik eller lipidomics udføres. Af ovennævnte grunde blev udvindingstiden for den nuværende protokol fastsat vilkårligt for at sikre tilfredsstillende følsomhed og dækning af metabolitter på den ene side og praktisk anvendelighed på stedet på den anden side.
Det skal understreges, at den meget lille størrelse af sonder, der anvendes til ekstraktion af prøver fra væv, kun forårsager minimale vævsskader, mens prøveudtagningsproceduren i sig selv ikke indtager væv, men meget små mængder små molekyler fra det afprøvede område; Den samme prøve kan derfor anvendes yderligere til rutinemæssige test, dvs. Sådanne komplementære, omfattende data vil muliggøre en bedre forståelse af tumor biologi, forhåbentlig lette opdagelsen af nye behandlingsmål. Udnyttelse af denne metode øger yderligere muligheden for intraoperativ diagnostik på stedet ved bestemmelse af målbiomarkører.
Nedenfor præsenterer vi protokoller for prøveudtagning af hjernetumorer på stedet for metabolomics og lipidomics analyser og databehandling.
Untargeted metabolomics og lipidomics er almindeligt anvendt i undersøgelser fokuseret på at identificere tumor biomarkører. Men, i de fleste tilfælde, forskere kigge efter forbindelser, der kan bruges til screening af sygdommen. Derfor er de foretrukne biologiske prøver blod eller urin på grund af deres relativt let adgang. Analyse af tumorvæv er hovedsageligt udføres for at forstå mekanismerne bag sygdommen, karakterisere forskellige tumortyper, osv. On-site analyse af tumor biomarkører er sjældent udføres, da sådanne anvendelser kræver omfattende prøve forberedelse. Alternativt, strategier baseret på real-time analyse af vævsprofiler uden forudgående udvælgelse af specifikke biomarkører tjener opmærksomhed fra den medicinske samfund3,4. Løsningen præsenteres heri giver et andet perspektiv på vævsbehandling på stedet ved at afsløre den type oplysninger, der kan fås via sådanne metoder.
Kombinationen af prøveudtagning, prøvepræparat og ekstraktion gør SPME til et meget nyttigt redskab til analyse på stedet. Desuden gør manglende vævsforbrug under prøveudtagningen det muligt at anvende de samme prøver yderligere til biomarkøranalyse og rutinetest (genotypebestemmelse, histologisk analyse), hvor der derfor tilføjes nye oplysninger til resultaterne af standardtesten. Prøvetagningsenheden har et meget enkelt design, dens funktion er meget let, og ingen særlig uddannelse er nødvendig for at udføre selve udvindingen. Men at opnå pålidelige resultater kræver meget mere end blot korrekt håndtering af enheder. For at udføre eksperimentet korrekt skal man forstå udvindingsprocessen, prøvens art og være opmærksom på potentielle fejl, der kan påvirke dataene.
Det er vigtigt at overveje heterogeniteten af kræftvæv10; tumorer, der er udtaget prøver af, kan indeholde dele, der gennemgår nekrose, forkalkning og hypoxi, og hver af disse processer vil blive afspejlet i metabolome og lipidome opnået, hvilket påvirker resultaterne. Derfor anbefales det, at rumlig opløsning prøveudtagning udføres ved indsættelse af flere fibre i forskellige dele af kræftvæv, eller alternativt, at en længere belægning skal anvendes til at trænge ind i hele tumoren for at opnå gennemsnitsoplysninger om tumoren. Hvis den rumlige opløsning prøvetagningsmetode udføres, kan fibrene alle desorberes i ét desorptionsopløsningsmiddel; Dette ville ikke kun give mulighed for opnåelse af generelle oplysninger om tumoren, men også øge følsomheden af analysen. Alternativt, desorption af de enkelte fibre i separate hætteglas ville gøre det muligt for undersøgelser at finde ud af den interne mangfoldighed af hjernetumor, som består af kernen bygget af kræftceller, og den ydre zone, som er grænsen for sundt væv. Dybere dele af tumoren er normalt mere beskadiget af de processer, relateret til kræft11. Men, efterforskere skal huske på, at denne mulighed kompromitterer metode følsomhed og det samlede antal påviselige forbindelser. I det nuværende arbejde blev der anvendt en 7 mm belægning; denne længde blev anset for optimal for forskellige størrelser af tumorer inkluderet i undersøgelsen. Belægningerne trængte ind i tumorer, og dermed forudsat ikke-særlig opløsning, men gennemsnit data på tværs af prøven. Uanset den valgte protokol, er det vigtigt, at den samme protokol følges under hele undersøgelsen, herunder antallet af fibre, der anvendes til individuel prøveudtagning, længden af belægningen, udvindingstid, og alle andre faktorer afgrænset i dette arbejde.
Det er vigtigt at kontrollere kvaliteten af analysen. Den samlede QC (se trin 4.7 og 7.7 i protokollen) skal fremstilles og anvendes til overvågning af instrumentets stabilitet under hele prøvebatchen. De tomme kontroller (se trin 2.8) kan senere bruges til at udarbejde en “udelukkelse liste” for at fjerne signaler af forurenende stoffer stammer fra opløsningsmidler eller fiber fremstilling. Ved særlige lejligheder, såsom risiko for kontaminering, er det nødvendigt at udtage prøver fra handsker, borde, apparater eller andre overflader, der kan udgøre en forureningsrisiko. I sådanne tilfælde, fiber forberedelse, tidspunktet for udvinding og desorption protokoller er de samme som for prøverne.
Metabolomic og lipidomic analyser er fokuseret udelukkende på små molekyler (mindre end 1.500 Da) optræder i en organisme eller specifikke komponenter i organismen, såsom specifikke organer, væv, væsker, celler, osv. Metabolomic og lipidomics tilbyder et øjebliksbillede af biokemiske ændringer, der forekommer i kroppen, og i tilfælde af kræft, de integrerer oplysninger relateret til genom, histologi, og malignitet af tumoren. Disse omics videnskaber skabe en sammenhæng mellem fysiologi og fænotype som metabolitter er højere oppe i den biokemiske stigen end proteiner eller gener12. Ved at forstå metabolom og lipidome af kræfttumorer, kommer vi tættere på at opdage fænotype blandt alle-omics videnskaber som disse grene af undersøgelsen tilbyder mere dybtgående viden om dynamiske ændringer af molekyler som en reaktion af levende organismer til forskellige stimuli. Som præsenteret i dette arbejde svarer de data, der er indhentet i en stikprøve, til kræftens histologi, dens grad af malignitet, og den afspejler ændringer, der sker på genomniveau. I gliomer, som den type kræft af interesse i denne undersøgelse, de oplysninger, der er skjult i genomet er særligt vigtigt, som en personlig behandling er udviklet baseret på resultaterne af genetiske tests. Særlige mutationer er prognostiske markører for resultaterne af kemo- eller strålebehandling. Som det fremgår her, er det muligt at vælge biomarkører, der afspejler en given mutation, med den foreslåede strategi. Mutation markører, samt yderligere beskrivelser typer som dem, der angiver graden af malignitet af tumoren kan også bruges til at støtte rutinemæssige diagnostiske metoder.
Ex vivo kemisk biopsi med brug af faste fase mikroekstræk fibre er det første skridt i anvendelsen af metoden til intraoperativ diagnostik. Metoden kan let anvendes til in vivo-prøvetagning, indtil der gives tilladelse fra relevante etiske råd. I sådanne tilfælde skal sterilisering af SPME-anordninger udføres i overensstemmelse med de godkendte sterilisationsprocedurer på det hospital, hvor der skal udtages prøver, dvs. De for konditionerede og steriliserede fibre skal opbevares i forseglede pakninger mærket med en sterilisationsudløbsdato. Det er vigtigt at bemærke, at fibre ikke bør rengøres med brug af overfladeaktive stoffer. En sådan procedure kan forårsage uspecifik ændringer i sorbent sammensætning, hvilket påvirker udvinding af analysand. I de undersøgelser, der er beskrevet heri, blev der anvendt en 30 min ekstraktionsperiode, men andre rapporter validerer, at kortere tider kan give tilfredsstillende resultater i in vivo-undersøgelser 13. Huq et al. viste, at analysand ligevægt tid opnås hurtigere i væv, som en kompleks matrix, end i simple matricer14. Reproducerbarheden af de opnåede resultater kan dog bringes i fare under kortere ekstraktionsperioder, da flere analysander vil blive udvundet under betingelser forud for ligevægten. derfor skal der gennemføres præcis tidskontrol.
Begge omics videnskaber udnyttes som en del af dette arbejde har fremragende potentiale som biomarkør opdagelse værktøjer. Når biomarkører er valgt, eller der er etableret en kemometrisk model, kan medicinsk diagnostik baseret på bestemmelse af målmetabolitter ved hjælp af metoder, der gælder for undersøgelser på stedet, såsom SPME-tilgangen, der er beskrevet i dette arbejde, udvikles og implementeres som en del af rutinemæssig diagnostik.
Den protokol, der foreslås i dette manuskript, beskriver, hvordan man udfører ikke-målrettede metabolomiske og lipidomic analyser af kræftvæv ved hjælp af fast fase mikroekstraktion til screening af potentielle biomarkører. Det er designet til at muliggøre udvinding af repræsentative forbindelser, differentiering af tumorer, og identifikation af diskriminerende forbindelser, der karakteriserer en given kræft, dvs potentielle biomarkører. De ikke-målrettede analyser med SPME, der er beskrevet i denne artikel, udgør et udgangspunkt i udviklingen af hurtig intraoperativ diagnostik, hvor et udvalgt panel af forbindelser kan bestemmes, uden at det er nødvendigt at screene alle forbindelser i prøven. Af hensyn til hurtige diagnostiske resultater kan SPME-sonder, der anvendes til udvinding på stedet, kobles direkte til analytisk instrumentering på hospitalet. Simple ekstraktioner udført med minimal prøvepræparat efterfulgt af kromatografifri analyse vil forkorte den samlede tid betydeligt fra timer til et par minutter, som allerede beskrevet for lægemiddelovervågning15.
The authors have nothing to disclose.
Undersøgelsen blev støttet af tilskud Harmonia 2015/18/M/ST4/00059 fra Det Nationale Videnskabscenter. Forfatterne vil gerne anerkende MilliporeSigma, en virksomhed af Merck KGaA, Darmstadt, Tyskland, for at levere SPME-enheder, der anvendes i dette arbejde. Mercks life science-virksomhed fungerer som MilliporeSigma i USA og Canada. Også forfatterne vil gerne takke Thermo Fisher Scientific for adgang til Q-Exactive Focus orbitrap massespektrometer.
Forfatternes bidrag: JB: optimering af prøveforberedelses- og LC-MS-parametre, udførelse af SPME-LC-MS-eksperimenter, dataanalyse, statistisk analyse og datafortolkning og forberedelse af manuskripter i forbindelse med lipidomics-del; PZG: koordinering og udførelse af størstedelen af prøverne på hospitalet, optimering af stikprøve- og prøveforberedelsesparametre, udførelse af SPME-LC-MS-forsøg, dataanalyse, statistisk analyse og datafortolkning, manuskriptforberedelse i forbindelse med metaabolomicsdel MG – bistand til optimering af prøveforberedelse, LC-MS-metode og dataanalyse relateret til lipidomics del; KG: sampræst til fælles ydeevne af SPME-prøver og optimering af prøveudtagning og prøvepræparat, SPME-LC-MS-analyse vedrørende metabolomikdel KC: udførelse af flere SPME-prøver på hospitalet, bistand til optimering af prøveudtagning, prøveforberedelse og dataanalyse vedrørende metabolomikdel KJ: udførelse af flere SPME prøver på hospitalet, bistand i lipidomics analyse; DP: udførelse af kirurgiske procedurer, rekruttering af patienter; JF: udførelse af kirurgiske procedurer, rekruttering af patienter; MH: udførelse af kirurgiske procedurer, koordinering af klinisk del af forskningen; BB: koncept, koordineringstilsyn med projektet og forberedelse af manuskripter, udførelse af flere stikprøver
acetic acid | Honeywell | 49199 | Mobile phase additive, LCMS grade |
acetonitrile | Honeywell | 34967 | HPLC solvent, LCMS grade |
ammonium acetate | Honeywell | 14267 | Mobile phase additive, LCMS grade |
BenchMixer MultiTube Vortexer | Benchmark Scientific | BV1010* | Vortex mixer |
caps | Agilent | 5183-2076 | Blue scrw tp,pre-slit PTFE/Si septa |
Compound Discoverer 2.1 | Thermo Scientific | software for data processing | |
Discovery HS F5 Supelguar Cartridge 2 cm × 2.1 mm, 3 μm | Supelco | 567571-U | Guard Column |
Discovery HS F5, 2.1 mm x 100 mm, 3 μm | Merck | 567502-U | HPLC Column |
formic acid | Honeywell | 56302 | Mobile phase additive, LCMS grade |
glass vial inserts 250ul , deactivated | Agilent | 5181-8872 | |
glass vial inserts 350ul | Agilent | 5188-5321 | |
glass vials 1.5ml | Agilent | 5183-2030 | |
glass vials, 2 mL (amber, deactivated) | Agilent | 5183-2072 | |
glass vials, 2mL | Agilent | 5182-0715 | |
HILIC Luna 3 μm, 200A, 100 x 2.0 mm | Shim-Pol | PHX-00D-4449-B0 | HPLC Column |
isopropanol | Honeywell | 34965 | HPLC solvent, LCMS grade |
LipidSearch 4.1 | Thermo Scientific | software for data processing | |
Metaboanalyst | Xia Lab @ McGill | online software for statistical analysis (Chong, J., Wishart, D.S. and Xia, J. (2019) Using MetaboAnalyst 4.0 for Comprehensive and Integrative Metabolomics Data Analysis. Current Protocols in Bioinformatics 68, e86 ) | |
methanol | Honeywell | 34966 | HPLC solvent, LCMS grade |
Pierce LTQ Velos ESI Positive Ion Calibration Solution | Thermo Scientific | 88323 | |
Pierce Negative Ion Calibration Solution | Thermo Scientific | 88324 | |
Q Exactive Focus hybrid quadrupole-Orbitrap MS | Thermo Scientific | 726049 | Mass Spectrometer |
SecurityGuard cartridge for HILIC, 4 mm × 2.0 mm | Phenomenex | KJ0-4282 | Guard Column |
SeQuant ZIC-cHILIC 3µm,100Å 100 x 2.1 mm | Merck | 1506570001 | HPLC Column |
SeQuant ZIC-HILIC Guard Kit 20 x 2.1 mm | Supelco | 1504360001 | Guard column |
SPME LC fiber probes, C18 | Supelco | custom order | comercial probes: 57281-U; probes used in the experiment were not needle assembled and were precut to the length described in the protocol |
SPME LC fiber probes, mixed Mode | Supelco | custom order | |
UltiMate 3000 HPLC systems | Thermo Scientific | 5200.0345 | HPLC system |
water | Merck | 1153331000 | HPLC solvent, LCMS grade |
XSelect CSH C18 3.5μm 2.1x75mm | Waters | 186005644 | HPLC Column |
XSelect CSH C18 VanGuard Cartridge, 3.5 µm, 3.9×5 mm | Waters | 186007813 | Column cartidge |