手稿介绍了人类脑肿瘤的现场采样与固相微extraction,然后其生化分析,以发现生物标志物。
尽管可用于癌症诊断和分类的工具种类繁多,但仍然需要能够快速、简单地对肿瘤进行表征的方法。近年来,质谱学已成为将歧视性化合物作为疾病的潜在生物标志物无目标分析的方法。生物流体通常被认为是可取的基质,因为其可访问性和更容易的样品处理,而直接组织分析提供了有关给定癌症的更具选择性的信息。通过传统方法准备组织分析要复杂得多,也更耗时,因此不适合快速现场分析。目前的工作提出了一个方案,结合样品制备和提取小分子现场,立即肿瘤切除。取样装置,这是针灸针的大小,可以直接插入到组织,然后运送到附近的实验室进行仪器分析。代谢组学和唇部学分析的结果表明,建立与肿瘤、恶性肿瘤和基因突变的组理起源有关的肿瘤表型,以及选择鉴别化合物或潜在生物标志物的方法,是有能力的。该技术的非破坏性允许随后对用于 SPME 分析的相同样本进行常规使用测试(如组织学测试)的检测,从而能够获得更全面的信息以支持个性化诊断。
磁共振成像(MRI)和计算机断层扫描(CT)是用于脑损伤实时分析的主要方法。脑肿瘤分化通常基于组织病理学与额外的染色和先进的免疫组织化学技术。根据世界卫生组织(WHO)2016年发布的中枢脑肿瘤最新指南,基因测试对于这些肿瘤的分化和分类至关重要。肿瘤的分化和分类使医生能够选择最有效的治疗特定类型的肿瘤,从而延长患者的预期寿命。不幸的是,尽管有这种先进的方法,以帮助医生选择最佳治疗他们的病人,诊断为胶质母细胞瘤(IV级胶质瘤)的患者的预期寿命只有约15-16个月2。即使该成像和组织学方法作为诊断工具的复杂和准确性提高,仍然非常需要新技术,能够提供补充信息,以帮助医生在治疗过程中作出决定。在过去的几年里,提出了几种基于质谱法的新方法,用于癌症3,4的术中分析。固相微extraction(SPME)作为一种快速现场分析工具,其潜力已在各种研究中得到证明。目前的手稿展示了该方法的临床应用之一,即人类脑肿瘤的无目标代谢组学和唇部。非目标调查是发现潜在生物标志物的重要起点。一旦建立,这种生物标志物,然后可以用作诊断参考,以区分肿瘤使用相同的技术耦合现场仪器。
SPME 是一种基于平衡的样品制备技术,利用少量提取阶段从样品基质中提取小分子。在SPME最传统的器件配置(探针)中,纤维涂有适当的萃取相,固定在固体支撑上,即金属线5、6。生物相容涂层和设备(探针)可直接从复杂的生物基质中提取,而无需样品预处理,例如均质和过滤。通过萃取过程,分析物按初始浓度的比例在萃取阶段和样品基质之间划分。如果萃取时间足够长,则达到平衡。虽然平衡时萃取可提供最高的灵敏度和可重复性,但在某些情况下,例如在体内取样,与现场采样(例如手术室或急诊室)相关的时间限制需要快速提取,均衡前萃取也是可能的,甚至更可取。给定分析物的萃取时间轮廓通常受分析物的物理化学特性、所采样的基质、使用的吸附剂类型和其他几个萃取条件的影响。当进行代谢组位或脂肪多基等非目标分析时,控制其提取动力学的大量因素几乎不可能确保所有化合物的平衡萃取。出于上述原因,对现行协议的提取时间进行任意设定,一方面确保代谢物的灵敏度和覆盖度令人满意,另一方面确保现场使用实用性。
应当强调,用于从组织中提取样品的探针尺寸非常小,只会造成最小的组织损伤,而取样程序本身并不消耗任何组织,而是从取样区域消耗少量小分子;因此,同一样本可进一步用于常规测试,即组织学或遗传学,从而获得来自同一样本的基本和补充信息。这些互补的、全面的数据将使对肿瘤生物学有了更好的了解,有望促进新的治疗目标的发现。利用这种方法,在确定目标生物标志物时,进一步增加了现场术中诊断的可能性。
下面我们介绍脑肿瘤现场采样方案,用于代谢组学和唇部分析及数据处理。
非目标代谢组学和唇部学片通常用于专注于识别肿瘤生物标志物的研究。然而,在大多数情况下,研究人员寻找可用于筛查疾病的化合物。因此,首选的生物样本是血液或尿液,因为他们相对容易获得。对肿瘤组织的分析主要是为了了解疾病背后的机位,描述不同肿瘤类型等。很少进行肿瘤生物标志物的现场分析,因为此类应用需要大量样品制备。另外,基于对组织特征进行实时分析而不预先选择特定生物标志物的策略正在引起医学界的注意。本文提供的解决方案通过揭示可通过此类方法获得的信息类型,为现场组织处理提供了另一个视角。
采样、样品制备和提取相结合使SPME成为现场分析非常有用的工具。此外,在取样过程中缺乏组织消耗,因此,可以进一步使用相同的样品进行生物标志物分析和常规测试(基因分型、组织学分析),从而为标准测试结果增加新的信息。取样装置设计非常简单,操作简单,无需特殊训练才能进行提取。然而,要获得可靠的结果,需要的不仅仅是对设备的正确处理。要正确执行实验,需要了解提取过程、样本的性质,并注意可能影响数据的潜在错误。
重要的是要考虑癌组织10的异质性;采样肿瘤可能包含发生坏死、钙化和缺氧的部分,这些过程将反映在所达到的代谢和脂质中,从而影响结果。因此,建议通过将几种纤维插入癌组织的不同部位进行空间分辨率采样,或者使用较长的涂层穿透整个肿瘤,以获得肿瘤的平均值。如果采用空间分辨率采样方法,纤维可以全部脱吸成一种脱吸溶剂;这不仅允许获得肿瘤的整体信息,而且增加分析的敏感性。或者,将单个纤维分离到单独的小瓶中,可以研究找出脑肿瘤的内部多样性,脑肿瘤由癌细胞组成,外侧区域是健康组织的边界。肿瘤的更深层部分通常更损坏与癌症相关的过程11。但是,调查人员必须记住,此选项会损害方法灵敏度和可检测化合物的总数。在目前的工作中,使用了7毫米涂层;这个长度被认为是最佳的肿瘤的大小包括在研究中。涂层穿透肿瘤,因此提供非特殊分辨率,但整个样品的平均数据。无论选择什么协议,在整个研究过程中必须遵循相同的协议,包括用于单独采样的纤维数量、涂层长度、提取时间以及本工作中描述的所有其他因素。
控制分析的质量非常重要。应准备池性质量控制(参见协议中的步骤 4.7 和 7.7),用于在整个样品批处理运行期间监控仪器稳定性。空白控制装置(参见步骤 2.8)可稍后用于准备”排除清单”,以消除来自溶剂或纤维制造的污染物信号。在特殊情况下(如存在污染风险)时,有必要对手套、桌子、仪器或任何其他可能构成污染风险的表面进行取样。在这种情况下,纤维制备、提取时间和脱吸协议与样品相同。
代谢和脂肪分析完全集中在出现在生物体或生物体的特定成分(如特定器官、组织、液体、细胞等)的小分子(小于1,500达) 上。代谢和脂肪学提供了在体内发生的生化变化的快照,在癌症的情况下,它们集成了与肿瘤的基因组、组织学和恶性肿瘤有关的信息。这些医学科学在生理学和表型之间创造了一种联系,因为代谢物在生化阶梯中高于蛋白质或基因12。通过了解癌肿瘤的代谢和脂质,我们更接近于发现所有医学科学中的表型,因为这些研究分支提供了更深入的知识,了解分子的动态变化,作为生物体对各种刺激的反应。如本工作介绍,在一次抽样中获得的数据与癌症组织学、恶性程度相对应,反映了基因组层面发生的变化。在胶质瘤中,作为本研究中感兴趣的癌症类型,隐藏在基因组中的信息尤为重要,因为基于基因测试结果开发了个性化治疗。特定的突变是化疗或放射治疗结果的预后标记。如此处所证明,使用建议的策略可以选择反映给定突变的生物标志物。突变标记,以及其他描述符类型,如那些指示肿瘤恶性程度也可用于支持常规诊断方法。
使用固相微外包纤维进行活体化学活检是该方法在术中诊断中应用的第一步。在获得适当道德委员会许可之前,该方法可以很容易地用于体内采样。在这种情况下,必须按照进行取样的医院的接受灭菌程序,即高压灭菌或环氧乙烷灭菌,对SPME装置进行灭菌。预调节和灭菌纤维必须保存在标有灭菌期日期的密封包装中。需要注意的是,不应使用表面活性剂清洁纤维。这种过程可能导致吸附剂组合物发生非特异性变化,从而影响分析物的提取。在本文所述的研究中,使用了30分钟的提取期,但其他报告证实,较短的时间可以在体内研究13产生令人满意的结果。 Huq等人表明,分析物平衡时间在组织中作为一个复杂的基质,比在简单基质14中更快。然而,由于在平衡前条件下提取更多的分析物,在较短的提取期内,获得的结果的可重复性可能会受到影响;因此,必须实施精确的时间控制。
作为这项工作的一部分,这两个奥米学科学都作为生物标志物发现工具具有极佳的潜力。一旦选择生物标志物或建立化学计量模型,就可以开发和实施基于通过适用于现场调查的方法(如本工作中描述的SPME方法)确定目标代谢物的医疗诊断,作为常规诊断的一部分。
本手稿中提出的方案描述了如何使用固体相微extraction对癌症组织进行非目标代谢和唇部分析,以筛选潜在的生物标志物。它旨在提取具有代表性的化合物,分化肿瘤,并识别具有给定癌症特征的歧视性化合物,即潜在的生物标志物。本文中描述的 SPME 非目标分析代表了快速术中诊断发展的起点,在该诊断中,无需筛选样品中所有化合物即可确定选定的化合物面板。为了快速诊断结果,用于现场提取的 SPME 探头可以直接与医院设施中的分析仪器耦合。简单的提取与最小的样品制备,然后色谱分析将显著缩短总时间从小时到几分钟,如已经描述的药物监测15。
The authors have nothing to disclose.
这项研究得到了国家科学中心授予哈莫尼亚2015/18/M/ST4/00059的支持。作者要感谢德国达姆施塔特默克KGaA的一家企业,该公司提供了本作品中使用的SPME设备。默克的生命科学业务在美国和加拿大以米利波雷西格玛为经营范围。此外,作者要感谢赛默费舍尔科学访问Q-精确聚焦轨道rap质谱仪。
作者的贡献:JB:优化样品制备和LC-MS参数,SPME-LC-MS实验的性能,数据分析,统计分析和数据解释,以及与唇部部分相关的手稿制备;PZG:在医院大多数抽样的协调和性能,优化采样和样品制备参数,SPME-LC-MS实验的性能,数据分析,统计分析和数据解释,与代谢组学部分相关的手稿准备;MG – 协助优化样品制备、LC-MS 方法和与唇部部分相关的数据分析;KG:SPME采样的共同性能,优化采样和样品制备,SPME-LC-MS分析相关代谢组学部分;KC:在医院进行多项SPME采样,协助优化采样、样品制备和代谢组学部分数据分析;KJ:在医院进行多项SPME采样,协助进行唇膜分析;DP:执行外科手术,招募患者;JF:执行外科手术,招募患者;MH:外科手术的运行,临床部分的协调研究;BB:概念、项目协调监督和稿件准备、多次抽样表现
acetic acid | Honeywell | 49199 | Mobile phase additive, LCMS grade |
acetonitrile | Honeywell | 34967 | HPLC solvent, LCMS grade |
ammonium acetate | Honeywell | 14267 | Mobile phase additive, LCMS grade |
BenchMixer MultiTube Vortexer | Benchmark Scientific | BV1010* | Vortex mixer |
caps | Agilent | 5183-2076 | Blue scrw tp,pre-slit PTFE/Si septa |
Compound Discoverer 2.1 | Thermo Scientific | software for data processing | |
Discovery HS F5 Supelguar Cartridge 2 cm × 2.1 mm, 3 μm | Supelco | 567571-U | Guard Column |
Discovery HS F5, 2.1 mm x 100 mm, 3 μm | Merck | 567502-U | HPLC Column |
formic acid | Honeywell | 56302 | Mobile phase additive, LCMS grade |
glass vial inserts 250ul , deactivated | Agilent | 5181-8872 | |
glass vial inserts 350ul | Agilent | 5188-5321 | |
glass vials 1.5ml | Agilent | 5183-2030 | |
glass vials, 2 mL (amber, deactivated) | Agilent | 5183-2072 | |
glass vials, 2mL | Agilent | 5182-0715 | |
HILIC Luna 3 μm, 200A, 100 x 2.0 mm | Shim-Pol | PHX-00D-4449-B0 | HPLC Column |
isopropanol | Honeywell | 34965 | HPLC solvent, LCMS grade |
LipidSearch 4.1 | Thermo Scientific | software for data processing | |
Metaboanalyst | Xia Lab @ McGill | online software for statistical analysis (Chong, J., Wishart, D.S. and Xia, J. (2019) Using MetaboAnalyst 4.0 for Comprehensive and Integrative Metabolomics Data Analysis. Current Protocols in Bioinformatics 68, e86 ) | |
methanol | Honeywell | 34966 | HPLC solvent, LCMS grade |
Pierce LTQ Velos ESI Positive Ion Calibration Solution | Thermo Scientific | 88323 | |
Pierce Negative Ion Calibration Solution | Thermo Scientific | 88324 | |
Q Exactive Focus hybrid quadrupole-Orbitrap MS | Thermo Scientific | 726049 | Mass Spectrometer |
SecurityGuard cartridge for HILIC, 4 mm × 2.0 mm | Phenomenex | KJ0-4282 | Guard Column |
SeQuant ZIC-cHILIC 3µm,100Å 100 x 2.1 mm | Merck | 1506570001 | HPLC Column |
SeQuant ZIC-HILIC Guard Kit 20 x 2.1 mm | Supelco | 1504360001 | Guard column |
SPME LC fiber probes, C18 | Supelco | custom order | comercial probes: 57281-U; probes used in the experiment were not needle assembled and were precut to the length described in the protocol |
SPME LC fiber probes, mixed Mode | Supelco | custom order | |
UltiMate 3000 HPLC systems | Thermo Scientific | 5200.0345 | HPLC system |
water | Merck | 1153331000 | HPLC solvent, LCMS grade |
XSelect CSH C18 3.5μm 2.1x75mm | Waters | 186005644 | HPLC Column |
XSelect CSH C18 VanGuard Cartridge, 3.5 µm, 3.9×5 mm | Waters | 186007813 | Column cartidge |