Messung transzellulärer Wechselwirkungen durch Proteinaggregation in einem heterologen Zellsystem
Summary
Hier präsentieren wir ein optimiertes Protokoll zur schnellen und semiquantitativen Messung von Liganden-Rezeptor-Wechselwirkungen in Trans in einem heterologen Zellsystem mittels Fluoreszenzmikroskopie.
Abstract
Protein-Wechselwirkungen an zellulären Schnittstellen diktieren eine Vielzahl von biologischen Ergebnissen, die von der Gewebeentwicklung und Krebsprogression bis hin zur Synapsenbildung und -erhaltung reichen. Viele dieser grundlegenden Wechselwirkungen treten bei Trans auf und werden typischerweise durch heterophile oder homophile Wechselwirkungen zwischen Zellen induziert, die membranverankerte Bindungspaare exdrücken. Die Aufklärung, wie krankheitsrelevante Mutationen diese grundlegenden Proteinwechselwirkungen stören, kann Einen Einblick in eine Vielzahl von Zellbiologiefeldern geben. Viele Protein-Protein-Interaktions-Assays sind in der Regel nicht uneindeutig zwischen cis und Trans-Wechselwirkungen, was potenziell zu einer Überschätzung des In-vivo-Bindungsumfangs führt und eine arbeitsintensive Reinigung von Protein- und/oder spezialisierten Überwachungsgeräten beinhaltet. Hier präsentieren wir ein optimiertes einfaches Protokoll, das die Beobachtung und Quantifizierung von nur Trans-Wechselwirkungen ohne langwierige Proteinreinigungen oder spezielle Geräte ermöglicht. Der HEK-Zellaggregationstest beinhaltet das Mischen von zwei unabhängigen Populationen von HEK-Zellen, die jeweils membrangebundene Cognateligaden exdrücken. Nach einer kurzen Inkubationszeit werden Proben abgebildet und die resultierenden Aggregate quantifiziert.
Introduction
Synaptische Wechselwirkungen, die durch synaptische Adhäsionsmoleküle erleichtert werden, sind die Grundlage für die Entwicklung, Organisation, Spezifikation, Wartung und Funktion von Synapsen und die Erzeugung von neuronalen Netzwerken. Die Identifizierung dieser transsynaptischen Zelladhäsionsmoleküle nimmt rapide zu; Daher ist es von grundlegender Bedeutung, verbindliche Partner zu identifizieren und zu verstehen, wie diese neuen Adhäsionsmoleküle miteinander interagieren. Zusätzlich hat die Genomsequenzierung Mutationen in vielen dieser Adhäsionsmoleküle identifiziert, die häufig mit einer Vielzahl von neuroentwicklungsbedingten, neuropsychiatrischen und Suchterkrankungen verbunden sind1. Mutationen in Genen, die für synaptische Zelladhäsionsmoleküle kodieren, können Trans-Wechselwirkungen nachteilig verändern und zu pathophysiologischen Veränderungen bei der Synapsenbildung und-Erhaltung beitragen.
Es gibt mehrere Assays zur quantitativen Bewertung von Protein-Protein-Wechselwirkungen wie isotherme Kalorimetrie, kreisförmiger Dichroismus, Oberflächen-Plasmonresonanz2 und obwohl quantitativ, haben sie mehrere Einschränkungen. Erstens benötigen sie rekombinantes Protein, das manchmal langwierige und mühsame Reinigungsschritte erfordert. Zweitens erfordern sie eine ausgeklügelte Spezialausrüstung und technisches Know-how. Drittens können sie das Bindungsgrad überschätzen, da sie sowohl cis- als auch Trans-Wechselwirkungen zwischen Proteinen ermöglichen, die natürlicherweise in vivo an eine Membran gebunden sind. Hier schlagen wir einen einfachen und relativ schnellen Assay vor, der ausschließlich Trans-Interaktionen testet.
Um viele der Komplikationen im Zusammenhang mit gereinigten Protein-Assays zu umgehen, haben wir einen zellbasierten Protein-Interaktionstest optimiert, der Trans-Interaktionen in einem reduzierten heterologen Zellsystem rekapituliert. Dieser Assay wurde zuvor in verschiedenen Formen verwendet, um transzelluläre Wechselwirkungen zu untersuchen. Bei diesem Ansatz werden Kandidatenzelladhäsionsmoleküle in HEK293T-Zellen transfiziert. Unter physiologischen Bedingungen weisen HEK293T-Zellen keine Selbstaggregation auf, so dass sie beispielhafte Modelle für diesen Test aufweisen. Wenn jedoch einzelne Populationen von HEK-Zellen, die Rezeptor und Liganden exexegieren, kombiniert werden, erzwingt die Bindung des Rezeptors und des Liganden die Aggregation von HEK-Zellen. Diese Aggregation wird ausschließlich durch Transinteraktionen vermittelt und ist in der Regel in Dutzenden von Minuten beobachtbar. Bei dieser Methode sind keine Proteinreinigungsschritte erforderlich, und die Effizienz der Methode beruht auf dem Paradigma, dass Populationen von HEK-Zellen, die Cognate-Adhäsionsmoleküle exdrücken, kombiniert und dann nur zig Minuten später abgebildet werden. Darüber hinaus ist diese Methode relativ kostengünstig, da weder Antikörper noch kostspielige Ausrüstung erforderlich sind. Die einzige Ausrüstung, die für die Erfassung von Daten benötigt wird, ist ein Standard-Fluoreszenzmikroskop. Ein weiterer Vorteil dieses zellbasierten Assays ist die Fähigkeit, die Wirkung krankheitsrelevanter Punktmutationen auf Trans-Wechselwirkungen schnell zu untersuchen. Dies kann durch Transfizieren von HEK-Zellen mit cDNAs der mutierten Varianten des Proteins von Interesse durchgeführt werden.
In diesem Protokoll stellen wir ein Beispiel vor, in dem wir untersuchen, ob sich eine Missense-Mutation in Neurexin3 “(Neurexin3”A687T), die bei einem Patienten mit einer tiefen geistigen Behinderung und Epilepsie identifiziert wurde, wechselwirkungen im Trans mit Leucin-reichem Repeat-Transmembranprotein 2 (LRRTM2) verändert. Neurexin3 ist ein Mitglied der evolutionär konservierten Familie von präsynaptischen Zelladhäsionsmolekülen und während neuere Arbeiten mehrere Rollen an der Synapseidentifizierthaben 3,4,5,6,7, bleibt unser synaptisches Verständnis dieses Moleküls und aller Mitglieder der Neurexin-Familie unvollständig. LRRTM2 ist ein exzitatorisches postsynaptisches Zelladhäsionsprotein, das an der Synapsenbildung und-erhaltung8,9,10teilnimmt. Wichtig ist, dass LRRTM2 ausschließlich mit Neurexin-Isoformen interagiert, denen die Spleißstelle 4 alternatives Exon (SS4-) fehlt, aber nicht mit Neurexin-Isoformen, die die Spleißstelle 4 alternatives Exon (SS4+) enthalten. Die menschliche Missense-Mutation (A687T), die in Neurexin3 identifiziert wurde, befindet sich in einer nicht untersuchten extrazellulären Region, die evolutionär konserviert ist und zwischen allen Alpha-Neurexinenkonserviertwird 7 . Da die Wechselwirkung zwischen diesen beiden Molekülen8,9,11festgestellt wurde, stellten wir die Frage: Wird die Bindungsfähigkeit von Neurexin3′ SS4- zu LRRTM2 durch eine A687T-Punktmutation verändert? Dieser Test ergab, dass die A687T-Punktmutation unerwartet die Aggregation von Neurexin3zu LRRTM2 verbesserte, was darauf hindeutet, dass die extrazelluläre Region, in der sich die Punktmutation befindet, eine Rolle bei der Vermittlung transsynaptischer Wechselwirkungen spielt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Sezieren der Protein-Protein-Wechselwirkungen, die während der Zelladhäsion im Trans auftreten, kann zu einem besseren Verständnis der molekularen Mechanismen führen, die grundlegenden zellulären Prozessen zugrunde liegen, einschließlich der Bildung, Funktion und Wartung von Synapsen während der Reifung und des Umbaus. Die Implikationen von Zell-zu-Zell-Interaktionen gehen über die Neurobiologie hinaus und spielen eine breitere Rolle bei der Signaltransduktion, Zellmigration und Gewebeentwicklung<sup class="x…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch Stipendien des National Institute of Mental Health (R00MH103531 und R01MH116901 to J.A.), ein Predoctoral Training Grant vom National Institute of General Medicine (T32GM007635 to S.R.) und ein Lyda Hill Gilliam Fellowship for Advanced Study (GT11021 to S.R.) unterstützt. Wir danken Dr. Kevin Woolfrey für die Hilfe beim Mikroskop, Dr. K. Ulrich Bayer für den Einsatz seines Epifluoreszenzmikroskops und Thomas Südhof (Stanford University) für das LRRTM2-Plasmid.
Materials
| 1.5 mL disposable microtubes with snap caps | VWR | 89000-028 | Incubation of mixed population of HEK cells |
| 1000 mL Rapid—Flow Filter Unit, 0.2 um aPES membrane | Thermo Fisher | 567-0020 | Sterilization of HEK media |
| 15 mL SpectraTube centrifuge tubes | Ward’s Science | 470224-998 | Harvesting HEK cells |
| 6 well sterile tissue culture plates | VWR | 100062-892 | culturing HEK cells |
| Calcium Chloride | Sigma | 223506-500G | Calcium phosphate transfection, HEK cell resuspension |
| Centrifuge- Sorvall Legend RT | Kendro Laboratory Products | 75004377 | Harvesting HEK cells |
| CO2 cell incubator | Thermo Scientific | HERACELL 150i | Incubation of HEK cells during growth |
| DMEM, 1x (Dulbecco's Modification of Eagle's Medium) with 4.5 g/L glucose, L-glutamine & sodium pyruvate | Corning | 10-013-CV | HEK cell maintenance |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline PBS (1X) | Gibco | 14190-144 | Passaging/harvesting HEK cell |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma | ED-500G | Harvesting HEK cells |
| Falcon Vented culture flasks, 75cm2 growth area | Corning | 9381M26 | Culturing HEK cells |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | 17L184 | HEK cell maintenance |
| HEK293T cells | ATCC | Model system | |
| ImageJ | NIH | V: 2.0.0-rc-69/1.52p | Image analysis |
| Magnesium Chloride hexahydrate | Sigma | M9272-500G | HEK cell resuspension |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous | Fisher BioReagents | BP332-500 | Calcium phosphate transfection |
| Trypsin 0.25% (1X) Solution | GE Healthcare Life Sciences | SH30042.01 | Passaging HEK cells |
| Tube rotator | Incubation of mixed population of HEK cells | ||
| UltraClear Microscope slides. White Frosted, Positive Charged | Denville Scientific Inc. | M1021 | Image acquisition |
| Wide-field microscope | Zeiss | Axio Vert 200M | Image acquisition |
Referencias
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