Studium der Auswirkungen von Zigarettenrauch auf Pseudomonas-Infektion in Lungenepithelzellen

Das Rauchen von Zigaretten beeinträchtigt die öffentliche Gesundheit von Millionen von Menschen weltweit. Viele schädliche Krankheiten, einschließlich Lungenkrebs und chronisch obstruktive Lungenerkrankung (COPD), werden berichtet, dass im Zusammenhang mit Zigarettenrauchen^1,2. Zigarettenrauchen erhöht die Anfälligkeit für akute mikrobielle Infektionen in den Atemwegen^3,4,5. Darüber hinaus belegen immer mehr Beweise, dass Zigarettenrauchen die Pathogenese vieler chronischer Erkrankungen verstärkt^6,7,8. Zum Beispiel kann Zigarettenrauchen virale oder bakterielle Infektionen erhöhen, die COPD-Exazerbation verursachen⁹. Unter den bakteriellen Krankheitserregern, die ätiologisch zur akuten Exazerbation von COPD beitragen, verursacht ein opportunistischer gramnegativer Bacillus-Erreger, Pseudomonas aeruginosa,Infektionen, die mit schlechten Prognosen und höheren Sterblichkeiten korrelieren^10,11. CopD-Exazerbation verschlimmert die Krankheit durch Beschleunigung der pathologischen Progression. Es gibt keine wirksamen Therapien gegen COPD-Exazerbation außer dem antisymptomatischen Management¹². COPD-Exazerbation fördert die Sterblichkeit der Patienten, verringert die Lebensqualität und erhöht die wirtschaftliche Belastung der Gesellschaft¹³.

Die Atemwege sind ein offenes System, das kontinuierlich verschiedenen mikrobiellen Krankheitserregern ausgesetzt ist, die extern vorkommen. Opportunistische bakterielle Krankheitserreger werden in der Regel in den oberen Atemwegen nachgewiesen, aber manchmal in den unteren Atemwegen^{beobachtet 14,15}. In Tiermodellen kann P. aeruginosa in alveolaren Säcken schon nach 1 h nach der Infektion¹⁶nachgewiesen werden. Als wichtiger Abwehrmechanismus eliminieren Immunzellen wie Makrophagen oder Neutrophilen die Bakterien in den Atemwegen. Lungenepithelzellen, als erste physiologische Barriere, spielen eine einzigartige Rolle in der Wirtsabwehr gegen mikrobielle Infektionen. Lungenepithelzellen können mikrobielle Invasion, Kolonisation oder Replikation unabhängig von Immunzellen regulieren¹⁷. Einige Moleküle, die in Epithelzellen gefunden werden, einschließlich PPARg, üben antibakterielle Funktionen aus und regulieren dadurch die bakterielle Besiedlung und Replikation in Lungenepithelzellen¹⁸. Zigarettenrauchen kann die Moleküle verändern und die normale Abwehrfunktion in den Lungenepithelzellen^19,20beeinträchtigen. Jüngste Studien berichteten über die direkte Exposition von Zigarettenrauch gegenüber Lungenepithelzellen mit Roboter-Raucherapparat^21,22. Die Exposition gegenüber Rauch kann jedoch auf andere Weise durchgeführt werden, einschließlich der Anwendung von CSE. Die Herstellung von CSE ist ein reproduzierbarer Ansatz mit möglichen Anwendungen in anderen Zelltypen, einschließlich vaskulärer Endothelzellen, die indirekt Zigarettenrauch ausgesetzt sind.

Dieser Bericht beschreibt ein Protokoll zur Erzeugung von Zigarettenrauchextrakt, um die bakterielle Belastung in Lungenepithelzellen zu verändern. CSE erhöht die bakterielle Belastung von P. aeruginosa, und es kann zum Wiederauftreten von bakteriellen Infektionen in der Regel bei COPD Exazerbation gesehen beitragen. Zur Herstellung von CSE wird eine konventionelle Methode verwendet. Lungenepithelzellen werden in ihrem exponentiellen Wachstumsstadium mit 4% CSE für 3 h behandelt. Alternativ können monolayer-kultivierte Lungenepithelzellen in einer luft-flüssigen Schnittstelle direkt Zigarettenrauch ausgesetzt werden. CSE-behandelte Zellen werden dann mit Pseudomonas bei einer Vielzahl von Infektionen (MOI) von 10 herausgefordert. Die Bakterien werden mit einer bestimmten Schüttelgeschwindigkeit vermehrt, um sicherzustellen, dass die Morphologie ihrer Flagella intakt bleibt, um ihre volle invasive Kapazität zu behalten. Gentamycin wird eingesetzt, um die im Kulturmedium zurückgelassenen Bakterien abzutöten und so die potenzielle Kontamination bei der anschließenden Bestimmung der Bakterienbelastung zu reduzieren. Das Protokoll verwendet auch GFP-markierte Pseudomonas, die als ein leistungsfähiges Werkzeug bei der Untersuchung Pseudomonas Infektion in verschiedenen Modellen verwendet wurde. Ein repräsentativer Stamm ist P. fluorescens Migula²³. Der Grad der Infektion oder bakterielle Belastung nach der CSE-Behandlung wird auf drei Arten bestimmt: die Fallplattenmethode mit Koloniezählung, quantitative PCR mit Pseudomonas 16S rRNA-spezifischen Primern oder die Durchflusszytometrie in Zellen, die mit fluoreszierenden Pseudomonasinfiziert sind. Dieses Protokoll ist ein einfacher und reproduzierbarer Ansatz, um die Wirkung von Zigarettenrauch auf bakterielle Infektionen in Lungenepithelzellen zu untersuchen.