Etablere en svin Ex Vivo Cornea modell for å studere narkotika behandlinger mot bakteriell keratitt
Summary
Denne artikkelen beskriver en trinnvis protokoll for å sette opp en ex vivo svin modell av bakteriell keratitt. Pseudomonas aeruginosa brukes som en prototypisk organisme. Denne innovative modellen etterligner in vivo infeksjon som bakteriell spredning er avhengig av bakteriens evne til å skade hornhinnenvev.
Abstract
Ved utvikling av nye antimikrobielle legemidler er suksessen til dyreforsøk avhengig av nøyaktig ekstrapolering av antimikrobiell effekt fra in vitro-tester til dyreinfeksjoner in vivo. De eksisterende in vitro-testene overvurderer vanligvis antimikrobiell effekt da tilstedeværelsen av vertsvev som diffusjonsbarriere ikke er rede for. For å overvinne denne flaskehalsen har vi utviklet en ex vivo svin hornhinnemodell av bakteriell keratitt ved hjelp av Pseudomonas aeruginosa som en prototypisk organisme. Denne artikkelen beskriver utarbeidelsen av svinekorn og protokoll for etablering av infeksjonen. Skreddersydde glassformer muliggjør enkelt oppsett av hornhinnen for infeksjonsstudier. Modellen etterligner in vivo infeksjon som bakteriell spredning er avhengig av bakteriens evne til å skade hornhinnenvev. Etablering av infeksjon verifiseres som en økning i antall kolonidannende enheter vurdert via levedyktige platetall. Resultatene viser at infeksjon kan etableres på en svært reproduserbar måte i ex vivo hornhinnen ved hjelp av metoden som er beskrevet her. Modellen kan utvides i fremtiden for å etterligne keratitt forårsaket av andre mikroorganismer enn P. aeruginosa. Det endelige målet med modellen er å undersøke effekten av antimikrobiell kjemoterapi på fremdriften av bakteriell infeksjon i et scenario som er mer representativt for in vivoinfeksjoner. Dermed vil modellen som er beskrevet her redusere bruken av dyr for testing, forbedre suksessratene i kliniske studier og til slutt muliggjøre rask oversettelse av nye antimikrobielle til klinikken.
Introduction
Hornhinneinfeksjoner er viktige årsaker til blindhet og forekommer i epidemiske proporsjoner i lav- og mellominntektsland. Etiologien til sykdommen varierer fra region til region, men bakterier står for et stort flertall av disse tilfellene. Pseudomonas aeruginosa er et viktig patogen som forårsaker en raskt progressiv sykdom. I mange tilfeller er pasienter igjen med stromal arrdannelse, uregelmessig astigmatisme, krever transplantasjon eller i verste fall mister et øye1,2.
Bakteriell keratitt forårsaket av P. aeruginosa er en vanskelig øyeinfeksjon å behandle spesielt på grunn av den økende fremveksten av antimikrobielle resistente stammer av P. aeruginosa. I løpet av det siste tiåret har det blitt klart at testing og utvikling av nye behandlinger for hornhinneinfeksjoner generelt, og de som er forårsaket av Pseudomonas sp., spesielt, er avgjørende for å bekjempe den nåværende trenden i antibiotikaresistens3.
For å teste effekten av nye behandlinger for hornhinneinfeksjoner, er konvensjonelle in vitro mikrobiologiske metoder et dårlig surrogat på grunn av forskjellen i bakteriell fysiologi under laboratoriekultur og under infeksjoner in vivo, samt på grunn av mangel på vertsgrensesnittet4,5. In vivo dyremodeller er imidlertid dyre, tidkrevende, kan bare levere et lite antall repliker og reise bekymringer om dyrevelferd.
I denne artikkelen demonstrerer vi en enkel og reproduserbar organotypisk ex vivo svinemodell av keratitt som kan brukes til å teste ulike behandlinger for akutte og kroniske infeksjoner. Vi har brukt P. aeruginosa for dette eksperimentet, men modellen fungerer også bra med andre bakterier, og organismer som sopp og gjær som forårsaker keratitt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den viktigste driveren bak utviklingen av denne keratitt modellen ved hjelp av ex vivo svin hornhinnen er å gi forskere utvikle nye antimikrobielle med en representativ in vitro modell for å mer nøyaktig bestemme antimikrobiell effekt på prekliniske stadier. Dette vil gi forskere som er involvert i å utvikle nye antimikrobielle legemidler større kontroll over legemiddeldesign og formulering på prekliniske stadier, øke suksessen i kliniske studier, redusere bruken av dyr ved å muliggjøre målrettede studier og r…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gjerne takke Elliot Abattoir i Chesterfield for å ha gitt svineøyne. Glassringene ble laget basert på vår design av glassblåseren Dan Jackson fra Department of Chemistry ved University of Sheffield. Forfatterne vil gjerne takke Medical Research Council (MR/S004688/1) for finansiering. Forfatterne vil også takke Fru Shanali Dikwella for teknisk hjelp med hornhinnen forberedelse. Forfatterne vil gjerne takke Mr Jonathan Emery for hjelp med formatering av bilder.
Materials
| 50 mL Falcon tube | SLS | 352070 | |
| Amphotericin B | Sigma | A2942 | |
| Cellstar 12 well plate | Greiner Bio-One | 665180 | |
| Dextran | Sigma | 31425-100mg-F | |
| Distel | Fisher Scientific | 12899357 | |
| DMEM + glutamax | SLS | D0819 | |
| Dual Oven Incubator | SLS | OVe1020 | Sterilising oven |
| Epidermal growth factor | SLS | E5036-200UG | |
| F12 HAM | Sigma | N4888 | |
| Foetal calf serum | Labtech International | CA-115/500 | |
| Forceps | Fisher Scientific | 15307805 | |
| Handheld homogeniser 220 | Fisher Scientific | 15575809 | Homogeniser |
| Heracell VIOS 160i | Thermo Scientific | 15373212 | Tissue culture incubator |
| Heraeus Megafuge 16R | VWR | 521-2242 | Centrifuge |
| Insulin, recombinant Human | SLS | 91077C-1G | |
| LB agar | Sigma | L2897 | |
| Multitron | Infors | Not appplicable | Bacterial incubator |
| PBS | SLS | P4417 | |
| Penicillin-Streptomycin | SLS | P0781 | |
| Petri dish | Fisher Scientific | 12664785 | |
| Petri dish 35x10mm CytoOne | Starlab | CC7672-3340 | |
| Povidone iodine | Weldricks pharmacy | 2122828 | |
| Safe 2020 | Fisher Scientific | 1284804 | Class II microbiology safety cabinet |
| Scalpel blade number 15 | Fisher Scientific | O305 | |
| Scalpel Swann Morton | Fisher Scientific | 11849002 |
Referencias
- Vazirani, J., Wurity, S., Ali, M. H. Multidrug-Resistant Pseudomonas aeruginosa Keratitis Risk Factors, Clinical Characteristics, and Outcomes. Ophthalmology. 122 (10), 2110-2114 (2015).
- Sharma, S. Keratitis. Bioscience Reports. 21 (4), 419-444 (2001).
- Sharma, G., et al. Pseudomonas aeruginosa biofilm: Potential therapeutic targets. Biologicals. 42 (1), 1-7 (2014).
- Ersoy, S. C., et al. Correcting a Fundamental Flaw in the Paradigm for Antimicrobial Susceptibility Testing. EBioMedicine. 20, 173-181 (2017).
- Kubicek-Sutherland, J. Z., et al. Host-dependent Induction of Transient Antibiotic Resistance: A Prelude to Treatment Failure. EBioMedicine. 2 (9), 1169-1178 (2015).
- Pinnock, A., et al. Ex vivo rabbit and human corneas as models for bacterial and fungal keratitis. Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 255 (2), 333-342 (2017).
- Harman, R. M., Bussche, L., Ledbetter, E. C., Van de Walle, G. R. Establishment and Characterization of an Air-Liquid Canine Corneal Organ Culture Model To Study Acute Herpes Keratitis. Journal of Virology. 88 (23), 13669-13677 (2014).
- Madhu, S. N., Jha, K. K., Karthyayani, A. P., Gajjar, D. U. Ex vivo Caprine Model to Study Virulence Factors in Keratitis. Journal of Ophthalmic & Vision Research. 13 (4), 383-391 (2018).
- Vermeltfoort, P. B. J., van Kooten, T. G., Bruinsma, G. M., Hooymans, A. M. M., vander Mei, H. C., Busscher, H. J. Bacterial transmission from contact lenses to porcine corneas: An ex vivo study. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 46 (6), 2042-2046 (2005).
- Duggal, N., et al. Zinc oxide tetrapods inhibit herpes simplex virus infection of cultured corneas. Molecular Vision. 23, 26-38 (2017).
- Brothers, K., et al. Bacterial Impediment of Corneal Cell Migration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (7), (2015).
- Alekseev, O., Tran, A. H., Azizkhan-Clifford, J. Ex vivo Organotypic Corneal Model of Acute Epithelial Herpes Simplex Virus Type I Infection. Journal of Visualized Experiments. (69), (2012).
- Sack, R. A., Nunes, I., Beaton, A., Morris, C. Host-Defense Mechanism of the Ocular Surfaces. Bioscience Reports. 21 (4), 463-480 (2001).
- Kunzmann, B. C., et al. Establishment of a porcine corneal endothelial organ culture model for research purposes. Cell and Tissue Banking. 19 (3), 269-276 (2018).
- Oh, J. Y., et al. Processing Porcine Cornea for Biomedical Applications. Tissue Engineering Part C-Methods. 15 (4), 635-645 (2009).
- Shi, W. Y., et al. Protectively Decellularized Porcine Cornea versus Human Donor Cornea for Lamellar Transplantation. Advanced Functional Materials. 29, 1902491-1902503 (2019).
- Menduni, F., Davies, L. N., Madrid-Costa, D., Fratini, A., Wolffsohn, J. S. Characterisation of the porcine eyeball as an in-vitro model for dry eye. Contact Lens & Anterior Eye. 41 (1), 13-17 (2018).
- Castro, N., Gillespie, S. R., Bernstein, A. M. Ex vivo Corneal Organ Culture Model for Wound Healing Studies. Journal of Visualized Experiments. (144), (2019).
