Het opzetten van een Porcine Ex Vivo Cornea Model voor het bestuderen van medicamenteuze behandelingen tegen bacteriële keratitis
Summary
Dit artikel beschrijft een stapsgewijs protocol om een ex vivo varkensmodel van bacteriële keratitis op te zetten. Pseudomonas aeruginosa wordt gebruikt als een prototypisch organisme. Dit innovatieve model bootst in vivo infectie na omdat bacteriële proliferatie afhankelijk is van het vermogen van de bacterie om hoornvliesweefsel te beschadigen.
Abstract
Bij de ontwikkeling van nieuwe antimicrobiële stoffen is het succes van dierproeven afhankelijk van nauwkeurige extrapolatie van antimicrobiële werkzaamheid van in vitro tests naar dierinfecties in vivo. De bestaande in vitro tests overschatten doorgaans de antimicrobiële werkzaamheid omdat de aanwezigheid van gastheerweefsel als diffusiebarrière niet wordt verantwoord. Om dit knelpunt te overwinnen, hebben we een ex vivo varkens corneamodel van bacteriële keratitis ontwikkeld met Pseudomonas aeruginosa als prototypisch organisme. Dit artikel beschrijft de voorbereiding van het varkensvlies en het protocol voor de vaststelling van de infectie. Op maat gemaakte glasvormen maken een eenvoudige installatie van het hoornvlies mogelijk voor infectiestudies. Het model bootst in vivo infectie na omdat bacteriële proliferatie afhankelijk is van het vermogen van de bacterie om hoornvliesweefsel te beschadigen. De vaststelling van de infectie wordt geverifieerd als een toename van het aantal kolonievormende eenheden dat via levensvatbare plaattellingen wordt beoordeeld. De resultaten tonen aan dat infectie op een zeer reproduceerbare manier kan worden vastgesteld in de ex vivo hoornvliezen met behulp van de hier beschreven methode. Het model kan in de toekomst worden uitgebreid om keratitis na te bootsen die wordt veroorzaakt door andere micro-organismen dan P. aeruginosa. Het uiteindelijke doel van het model is om het effect van antimicrobiële chemotherapie op de voortgang van bacteriële infectie te onderzoeken in een scenario dat meer representatief is voor in vivo infecties. Hierdoor zal het hier beschreven model het gebruik van dieren voor tests verminderen, de slagingspercentages in klinische proeven verbeteren en uiteindelijk een snelle vertaling van nieuwe antimicrobiële stoffen naar de kliniek mogelijk maken.
Introduction
Hoornvliesinfecties zijn belangrijke oorzaken van blindheid en komen voor in epidemische proporties in lage- en middeninkomenslanden. De etiologie van de ziekte varieert van regio tot regio, maar bacteriën zijn verantwoordelijk voor een grote meerderheid van deze gevallen. Pseudomonas aeruginosa is een belangrijke ziekteverwekker die een snel progressieve ziekte veroorzaakt. In veel gevallen blijven patiënten achter met stromale littekens, onregelmatig astigmatisme, moeten ze worden getransplanteerd of verliezen ze in het ergste geval een oog1,2.
Bacteriële keratitis veroorzaakt door P. aeruginosa is een moeilijke ooginfectie om te behandelen, vooral vanwege de toenemende opkomst van antimicrobiële resistente stammen van P. aeruginosa. In het afgelopen decennium is gebleken dat het testen en ontwikkelen van nieuwe behandelingen voor hoornvliesinfecties in het algemeen, en die veroorzaakt door Pseudomonas sp., in het bijzonder, essentieel zijn om de huidige trend in antibioticaresistentie te bestrijden3.
Voor het testen van de werkzaamheid van nieuwe behandelingen voor hoornvliesinfecties zijn conventionele in vitro microbiologische methoden een slecht surrogaat vanwege het verschil in bacteriële fysiologie tijdens laboratoriumkweek en tijdens infecties in vivo en vanwege het ontbreken van de gastheerinterface4,5. In vivo diermodellen zijn echter duur, tijdrovend, kunnen slechts een klein aantal replica’s opleveren en zorgen oproepen over dierenwelzijn.
In dit artikel demonstreren we een eenvoudig en reproduceerbaar organotypisch ex vivo varkensmodel van keratitis dat kan worden gebruikt om verschillende behandelingen voor acute en chronische infecties te testen. We hebben P. aeruginosa gebruikt voor dit experiment, maar het model werkt ook goed samen met andere bacteriën en organismen zoals schimmels en gist die keratitis veroorzaken.
Protocol
Representative Results
Discussion
De belangrijkste drijfveer achter de ontwikkeling van dit keratitismodel met behulp van ex vivo varkensmaïs is om onderzoekers die nieuwe antimicrobiële stoffen ontwikkelen een representatief in vitro model te bieden om de antimicrobiële werkzaamheid in de preklinische stadia nauwkeuriger te bepalen. Dit zal onderzoekers die betrokken zijn bij de ontwikkeling van nieuwe antimicrobiële stoffen meer controle geven over het ontwerp en de formulering van geneesmiddelen in de preklinische stadia, het succes bij klinische …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen Elliot Abattoir in Chesterfield bedanken voor het verstrekken van varkensogen. De glazen ringen zijn gemaakt op basis van ons ontwerp door de glasblazer Dan Jackson van het Department of Chemistry van de Universiteit van Sheffield. De auteurs willen de Medical Research Council (MR/S004688/1) bedanken voor de financiering. De auteurs willen ook mevrouw Shanali Dikwella bedanken voor de technische hulp bij de bereiding van het hoornvlies. De auteurs willen de heer Jonathan Emery bedanken voor zijn hulp bij het opmaken van foto’s.
Materials
| 50 mL Falcon tube | SLS | 352070 | |
| Amphotericin B | Sigma | A2942 | |
| Cellstar 12 well plate | Greiner Bio-One | 665180 | |
| Dextran | Sigma | 31425-100mg-F | |
| Distel | Fisher Scientific | 12899357 | |
| DMEM + glutamax | SLS | D0819 | |
| Dual Oven Incubator | SLS | OVe1020 | Sterilising oven |
| Epidermal growth factor | SLS | E5036-200UG | |
| F12 HAM | Sigma | N4888 | |
| Foetal calf serum | Labtech International | CA-115/500 | |
| Forceps | Fisher Scientific | 15307805 | |
| Handheld homogeniser 220 | Fisher Scientific | 15575809 | Homogeniser |
| Heracell VIOS 160i | Thermo Scientific | 15373212 | Tissue culture incubator |
| Heraeus Megafuge 16R | VWR | 521-2242 | Centrifuge |
| Insulin, recombinant Human | SLS | 91077C-1G | |
| LB agar | Sigma | L2897 | |
| Multitron | Infors | Not appplicable | Bacterial incubator |
| PBS | SLS | P4417 | |
| Penicillin-Streptomycin | SLS | P0781 | |
| Petri dish | Fisher Scientific | 12664785 | |
| Petri dish 35x10mm CytoOne | Starlab | CC7672-3340 | |
| Povidone iodine | Weldricks pharmacy | 2122828 | |
| Safe 2020 | Fisher Scientific | 1284804 | Class II microbiology safety cabinet |
| Scalpel blade number 15 | Fisher Scientific | O305 | |
| Scalpel Swann Morton | Fisher Scientific | 11849002 |
Referencias
- Vazirani, J., Wurity, S., Ali, M. H. Multidrug-Resistant Pseudomonas aeruginosa Keratitis Risk Factors, Clinical Characteristics, and Outcomes. Ophthalmology. 122 (10), 2110-2114 (2015).
- Sharma, S. Keratitis. Bioscience Reports. 21 (4), 419-444 (2001).
- Sharma, G., et al. Pseudomonas aeruginosa biofilm: Potential therapeutic targets. Biologicals. 42 (1), 1-7 (2014).
- Ersoy, S. C., et al. Correcting a Fundamental Flaw in the Paradigm for Antimicrobial Susceptibility Testing. EBioMedicine. 20, 173-181 (2017).
- Kubicek-Sutherland, J. Z., et al. Host-dependent Induction of Transient Antibiotic Resistance: A Prelude to Treatment Failure. EBioMedicine. 2 (9), 1169-1178 (2015).
- Pinnock, A., et al. Ex vivo rabbit and human corneas as models for bacterial and fungal keratitis. Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 255 (2), 333-342 (2017).
- Harman, R. M., Bussche, L., Ledbetter, E. C., Van de Walle, G. R. Establishment and Characterization of an Air-Liquid Canine Corneal Organ Culture Model To Study Acute Herpes Keratitis. Journal of Virology. 88 (23), 13669-13677 (2014).
- Madhu, S. N., Jha, K. K., Karthyayani, A. P., Gajjar, D. U. Ex vivo Caprine Model to Study Virulence Factors in Keratitis. Journal of Ophthalmic & Vision Research. 13 (4), 383-391 (2018).
- Vermeltfoort, P. B. J., van Kooten, T. G., Bruinsma, G. M., Hooymans, A. M. M., vander Mei, H. C., Busscher, H. J. Bacterial transmission from contact lenses to porcine corneas: An ex vivo study. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 46 (6), 2042-2046 (2005).
- Duggal, N., et al. Zinc oxide tetrapods inhibit herpes simplex virus infection of cultured corneas. Molecular Vision. 23, 26-38 (2017).
- Brothers, K., et al. Bacterial Impediment of Corneal Cell Migration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (7), (2015).
- Alekseev, O., Tran, A. H., Azizkhan-Clifford, J. Ex vivo Organotypic Corneal Model of Acute Epithelial Herpes Simplex Virus Type I Infection. Journal of Visualized Experiments. (69), (2012).
- Sack, R. A., Nunes, I., Beaton, A., Morris, C. Host-Defense Mechanism of the Ocular Surfaces. Bioscience Reports. 21 (4), 463-480 (2001).
- Kunzmann, B. C., et al. Establishment of a porcine corneal endothelial organ culture model for research purposes. Cell and Tissue Banking. 19 (3), 269-276 (2018).
- Oh, J. Y., et al. Processing Porcine Cornea for Biomedical Applications. Tissue Engineering Part C-Methods. 15 (4), 635-645 (2009).
- Shi, W. Y., et al. Protectively Decellularized Porcine Cornea versus Human Donor Cornea for Lamellar Transplantation. Advanced Functional Materials. 29, 1902491-1902503 (2019).
- Menduni, F., Davies, L. N., Madrid-Costa, D., Fratini, A., Wolffsohn, J. S. Characterisation of the porcine eyeball as an in-vitro model for dry eye. Contact Lens & Anterior Eye. 41 (1), 13-17 (2018).
- Castro, N., Gillespie, S. R., Bernstein, A. M. Ex vivo Corneal Organ Culture Model for Wound Healing Studies. Journal of Visualized Experiments. (144), (2019).
