CXCR4在Murine B-1a细胞上的逆转录病毒过度表达和靶向B-1a细胞向骨髓和IgM生产转移的采用转移

最近的研究表明，相当多的免疫细胞，特别是B细胞，皮质和功能异质性取决于细胞定位^{11，2，3，4，5。2,3,4,5}B-1a细胞是具有异质性产生保护性IgM抗体的杂质能力的一个群体;骨髓B-1a细胞分泌IgM，对血浆IgM成形¹⁰剂⁶有显著贡献，而心内性B-1a细胞在平衡性时具有低水平IgM分泌，而是可以通过先天多收费的受体（TLR）或细胞因子介导的信号激活，以迅速增殖、迁移和分泌IgM7、8、9。^7,8,9,B-1a细胞IgM抗体可识别病原体、凋亡细胞和氧化LDL上存在的氧化特异性表皮（OSE），与OSE结合的IgM可以预防动脉粥样硬化¹¹等疾病的炎症性下游信号。因此，通过增加对骨髓等部位的细胞迁移来增加IgM产量的策略可能具有治疗性。然而，这种策略必须针对和细胞类型特定，因为非目标效应可能对免疫功能或健康产生负面影响。

在这里，我们描述了一种在原鼠B-1a细胞中针对和长期过度表达CXCR4的方法，以及随后的采用转移，以可视化细胞迁移和功能IgM抗体的产生（图1）。与转化细胞系的转染相比，原发B细胞的基因操作受到转染效率低的限制。然而，由于转化的细胞系可以显著偏离原细胞^{1212，13，13}使用原细胞可能会提供的结果，更紧密地配合正常生理。在原鼠B细胞的基因转移中，已经描述了几种技术，包括逆转录病毒转导、脱病毒转导、脂肪化或电穿孔型转染，其效率、转化性和对细胞健康的影响^{13、14、15。,1513,}以下方法采用逆转录病毒转导，因为它产生了足够的基因转移效率>30%，同时对细胞生存能力的影响最小。CXCR4表达逆转录病毒是使用前面描述的逆转录病毒构造鼠干细胞-内部核糖体进入部位-绿色荧光蛋白（MSCV-IRES-GFP） 产生的;MigR1）^16，其中小鼠CXCR4基因被子克隆^4。MigR1（控制（Ctl）-GFP和CXCR4-GFP逆转录病毒颗粒是使用磷酸盐钙转染产生的，如先前公布的协议^44、1414所述。

成功转导的B-1a细胞随后被静脉注射转移到淋巴细胞缺乏的^{Rag1-/—-小鼠}中。供体小鼠和受体小鼠还含有对脂蛋白E（ApoE）基因的敲除，导致OSE积累和动脉粥样硬化增加，从而为体内B-1细胞活化和IgM生产提供了一个模型。此外，供体小鼠和受体小鼠在CD45等位型上有所不同;供体B-1细胞来自CD45.1+ApoE-/—–^小鼠，并转移到^Rag1-/- CD45.2+ApoE-/——^受体。这允许在移植后将供体CD45.1与受体CD45.2 B细胞区分，而无需在流细胞测量分析期间为B细胞标记额外染色。这里提供的结果表明，B-1a细胞上的目标CXCR4过度表达与B-1a细胞迁移到骨髓的能力增强有关，骨髓与血浆抗OSE IgM增加有关。我们还提供了一种通过负选择来丰富圆锥体B-1细胞的方法，并演示了B-1细胞激活对有效转导的要求。该方法可应用于其他逆转录病毒构造，以研究蛋白质过度表达对B-1a细胞迁移、表型或功能的影响。此外，使用CD45.1与CD45.2等位基因区分理论上可以允许转移到含有内源性B细胞的其他免疫足够的鼠型。