אופטימיזציה של כליות אורגאיד ותרבות אורגנותית לvascularization, פיתוח מורחב והדמיה מיקרוסקופית משופרת
Summary
עבודה זו מתארת שתי שיטות למחקר התפתחות איברים, התקנה משופרת xenotransplantation שתלת על ממברנה כוראולאנטואית (CAM) מעוברי העופות המאפשר vascularization של איברים עובריים ואורגנואידים הרומן קבוע z-כיוון שיטת תרבות האיברים עם תנאים ניסיוני שונה המאפשר הדמיה ברזולוציה גבוהה מיקוד הזמן.
Abstract
התרבויות העובנותיות בכליות, ובעיקר בתאי גזע מסוג pluripotent, הם כלים מצוינים לטיפול בתהליכים ההתפתחותיים ובמחלת כליות הדוגמנות. עם זאת, המודלים מוגבלים על ידי חוסר vascularization ופונקציונליות. כדי לענות על כך, פרוטוקול משופר עבור השיטה של השתלת תאים ורקמות של xenooallאנטומי הקרום (CAM) של העובר העופות לקבל vascularization ושחזור זרימת הדם פותחה. השתלים מצופים בהתאמה אישית מיני מאגרים כי לתקן את הדגימות כדי CAM ולספק להם במדיום התרבות המגנה על השתלים מייבוש. שיטת התרבות המשופרת מאפשרת לגדל שתלי xenografts עד 9 ימים. כתב היד גם מתאר כיצד לספק תנאים אופטימליים לדימות ממוקד לטווח ארוך של מארגני כליות ותרבויות אורגאוטימית באמצעות שיטת הפעולה שפורסמה בעבר כיוון Z (FiZD). שיטה זו דוחסת בעדינות איבר עובריים או אורגנואיד בין שמיכות זכוכית ממברנה בכמות גדולה של בינונית ומספק תנאים מצוינים לדימות עד 12 ימים. ביחד, שיטות אלו מאפשרות זרימת הדם והזרמת דם לאורגנואידים כליות ולתרביות כליות אורגאוטיאית עם הדמיה משופרת של מיקוד. השיטות המתוארות כאן הן מועילות מאוד ללימוד פונקציות בסיסיות ומוחלות של כליות לשעבר vivo. שתי השיטות חלות על סוגים שונים של רקמות ואורגנואידים.
Introduction
התרבות האורגנותית של הכליות העובריים הפכה למודל חשוב ללמוד נפרוגנזה לפני עשורים1,2,3. אורגנואידים כליות מייצגים מערכת מודל מתקדמת לחקר התפתחות של כליות בריאה וחולה4. עם זאת, החיסרון העיקרי בשתי השיטות הוא שהשיטה אינה משנה את התפקוד העיקרי של הכליה: סינון דם. הנליות והכליות מתפתחות בתרביות כליות ובתרבויות אורגנואיות, בדומה לשלב מוקדם בפיתוח vivo; עם זאת, הפקולי הנוצרת בתוך מבחנה, נשארות נמק העצם5. Vascularization לשעבר הכליות העובריים ואורגנואידים הכליה הפגינו בעבר ניסויים השתלת רק תחת בתנאים vivo. לדוגמה, השתלת תא גזע בעוצמה האנושית של כליות מתחת לקפסולה העכבר מאפשר פיתוח של הנליות בארגון האורגנואיד לשלב פונקציונלי6.
גישה ביניים בין גרידא בתרבויות מבחנה ובשיטות השתלת vivo הוא xenotransplantation שתלת כדי מצלמת עוברי העופות. Vascularization של כליה כליות העכבר השלם הוכח בעבר באמצעות מערכת זו7,8. עם זאת, זה הוכח גם כי הכליות כליות בכליה murine המושתלים היה נגזר מהמארח אנדותל, לא את השתל9. התבוננות זו הפחיתה באופן משמעותי את הפוטנציאל של מודלים של כליה עובריים (העופות-יונקים) של כלייה מתחלקים ללמוד פיתוח של הכליות כליות, כי התנאים הניסיוניים היו לא מתירני להישרדות של תאים שמקורם בתורמים.
המוצגים בחלק הראשון של פרוטוקול זה היא שיטה משופרת לטיפוח של כליות עובריים של העכבר על מצלמת ביצי עופות, שילוב של תנאים מיקרו סביבתיים של תרבות ארגונית ו-xenotransplantation שתלת. השיפור העיקרי השיטות הקודמות היא כי במקום למקם את הכליות מעובריים וכליות אורגנואידים ישירות על מצלמת הרשת, אזור ההשתלה מצופה במיני מאגרים חדיר מלאים במדיום התרבות כי לספק את הרקמה המושתלת עם חומרים מזינים ולהגן עליו מפני ייבוש. שיעור ההצלחה של הניסויים גדל באופן משמעותי והתנאים לפיתוח של ואסיקובלטורה המופק על ידי תורמים משפרים. היישום של שיטה זו לתרבויות xenotransplant שתלות תוצאות בפיתוח של בנייה של הפקלותתיל מורכב של תאים אנדוגאל אנדוסוגאל מכליות התורמים.
ניתוח מפורט של הסלולר מורפולגנזה הוא יישום נוסף חשוב של מודלים תרבות הכליה. שיטות שדווחו בעבר על רכישת תמונות בזמן הקפיצה של תרביות כליות מספיקות רק לניתוח של מורפולוגיה כוללת ומחקר של כליה עובריים, אך לא למעקב אחר תאים בודדים10. לאחרונה, הרומן קבוע Z-כיוון (fizd) שיטה שמטרתה ברזולוציה גבוהה קונפוקלית וקד 3d זמן הדמיה של מאורגנואידים כליות ותרבויות אורגאוטימית תוארה11. בשיטה זו, אורגנואידים והאיברים העובריים דחוסים בעדינות בין שמיכות זכוכית קרום חדיר של הכנס transwell בלוח מעוצב מותאם אישית עד עובי המדגם מגיע 70 μm, מתן תנאים אופטיים אופטימליים עבור הדמיה. בחלק השני של השיטות, פרוטוקול מפורט לייצור של צלחת מעוצב מותאם אישית והכיוונון של הניסויים FiZD עבור הדמיה לטווח ארוך של אורגנואיד מתואר.
Protocol
Representative Results
Discussion
שני פרוטוקולים מפורטים מוצגים המחדד את שיטת התרבות הקלאסית כליות אורגנותמית, ולאפשר vascularization, התפתחות מורחבת, ו 4D אופטימלי (כלומר, 3D תמונה וזמן) הדמיה של כליות vivo עובריים ואורגנואידים. סעיף זה מדגיש את השלבים הקריטיים בשיטות ודן בפתרון בעיות.
ההבדל המשמעותי בין שיטות אחרות ש…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכת מבחינה פיננסית על ידי האקדמיה האקדמית של פינלנד (206038, 121647, 250900, 260056; מרכז המצוינות בהענקת 2012-2017 251314), מונאיזזזאקאז-פינית כליה וכליות, האגודה השוודית לתרבות בפינלנד, ויקטוריה, הקרן השבדית. נובו Nordisk, מערכת הסרטן (האגודה הסרטנית של פינלנד), תוכנית המסגרת השביעית של הקהילה האירופית (FP7/2007-2013; גרנט FP7-בריאות-F5-2012-חדשנות -1 EURenOmics 305608), ו H2020 מארי Sklodowska-קירי פעולות הדרכה חדשני רשת “RENALTRACT דרכי” פרויקט מזהה 642937. המחברים מודים לפאולה הייפוס, ג’ואנה קקולאטי-ליפיי והאננלסון היקמן לסיוע טכני.
מספרים 3, 4 ו-Movie 2 מודפס באישור מפיתוח.
Materials
| Adjustable Spade Drill Bit | Bosch | 2609255277 | For drilling 20 mm diameter holes |
| Automatic Egg Turner | OLBA B.V., Netherlands | AT-42 | For incubation of eggs before ex ovo setup. |
| Cell Incubator | Panasonic | 13090543 | Temperature set at 37° C, 90% humidity, 5% CO2 |
| Cell Incubator | SANYO | 10070347 | Chicken CAM-culture incubator. Temperature set at 37° C, 90% humidity, 5% CO2 |
| Cellstar 6-well Plate | Greiner | M9062 | 16 mm depth of wells to match with the inserts |
| Circular Saw Blade for Dremel Rotary Tool | Dremel | SC690 | |
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM780 | |
| Corning Transwell Multiple Well Plate with Permeable Polycarbonate Membrane Inserts | Corning | 10301031 | For 6-well plates. 40 µm pore size |
| Countersink Drill Bit | Craftomat, Bauhaus | 22377902 | For polishing (20.5 mm, 1/4", HSS) |
| Disposable Glass Capillary Tube | Blaubrand | 7087 33 | |
| Disposable Scalpel | Swann-Morton | 0501 | |
| Dissecting Microscope | Olympus | SZ61 | |
| Drilling Machine | Bosch | GSR 18 V-EC Professional | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Sigma | D777 | High glucose |
| Egg Incubator Compact S84 | Grumbach, Germany | 8012 | For incubation of eggs before ex ovo setup. Temperature set at 38° C with relative humidity set above 60% |
| Ethanol (70%) | VWR | ||
| Fertilized Eggs | Haaviston Siitoskanala, Panelia, Finland | Hy-Line White and Nick Chick | |
| Fetal Bovine Serum | HyClone | SH3007003HI Thermo Scientific | |
| Forceps DUMONT #5 | Dumont | #5SF | |
| Glass Coverslips | Menzel-Gläser | Menzel BBAD02200220#A1TBCMNZ#0## | 22×22 mm |
| Histoacryl Glue | Braun | 1050052 | |
| Matrigel | Corning | 356230 | |
| On-stage Incubator | Okolab | Boldline, custom made | |
| PBS -/- | Corning | 20-031-CV | |
| PBS +/+ | Biowest | X0520-500 | Washing the mini reservoirs. |
| Penicillin and Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Polystyrene Beads | Corpuscular | 1000263-10 | 70 µm in diameter |
| Rotary Multi Tool System | Dremel | 4000 | |
| Soldering Iron | Weller | TCP S | Heated glass capillary can also be used |
| Thincert 12-well Cell Culture Inserts With 0.4 µm-pore Polystyrene Membrane | Greiner Bio-One | 665641 | |
| Thincert 6-well Cell Culture Inserts With 0.4 µm-pore Polystyrene Membrane | Greiner Bio-One | 657610 |
Referencias
- Saxen, L., Wartiovaara, J. Cell contact and cell adhesion during tissue organization. International Journal of Cancer. 1 (3), 271-290 (1966).
- Saxen, L., Toivonen, S., Vainio, T., Korhonen, P. Untersuchungen über die tubulogenese der niere. Zeitschrift Für Naturforschung. 20 (4), (1965).
- Saxen, L. . Organogenesis of the Kidney. 1st ed. , (1987).
- Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 536 (7615), 238 (2016).
- Halt, K. J., et al. CD146+ cells are essential for kidney vasculature development. Kidney International. 90, 311-324 (2016).
- van den Berg, C. W., et al. Renal Subcapsular Transplantation of PSC-Derived Kidney Organoids Induces Neo-vasculogenesis and Significant Glomerular and Tubular Maturation In Vivo. Stem Cell Reports. 10 (3), 751-765 (2018).
- Sariola, H., Ekblom, P., Lehtonen, E., Saxen, L. Differentiation and vascularization of the metanephric kidney grafted on the chorioallantoic membrane. Biología del desarrollo. 96 (2), 427-435 (1983).
- Sariola, H. Incomplete fusion of the epithelial and endothelial basement membranes in interspecies hybrid glomeruli. Cell Differentiation. 14 (3), 189-195 (1984).
- Ekblom, P., Sariola, H., Karkinen-Jääskeläinen, M., Saxén, L. The origin of the glomerular endothelium. Cell Differentiation. 11 (1), 35-39 (1982).
- Short, K. M., et al. Global Quantification of Tissue Dynamics in the Developing Mouse Kidney. Developmental Cell. 29, 188-202 (2014).
- Saarela, U., et al. Novel fixed z-direction (FiZD) kidney primordia and an organoid culture system for time-lapse confocal imaging. Development. 144 (6), 1113-1117 (2017).
- Yalcin, H. C., Shekhar, A., Rane, A. A., Butcher, J. T. An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications. Journal of Visualized Experiments. 44, e2154 (2010).
- Schomann, T., Qunneis, F., Widera, D., Kaltschmidt, C., Kaltschmidt, B. Improved method for ex ovo-cultivation of developing chicken embryos for human stem cell xenografts. Stem Cells International. 2013, 960958 (2013).
- Prunskaite-Hyyryläinen, R., et al. Wnt4 coordinates directional cell migration and extension of the Müllerian duct essential for ontogenesis of the female reproductive tract. Human Molecular Genetics. 25 (6), 1059-1073 (2016).
- Gustafsson, E., Brakebusch, C., Hietanen, K., Fässler, R. Tie-1-directed expression of Cre recombinase in endothelial cells of embryoid bodies and transgenic mice. Journal of Cell Science. 114, 671-676 (2001).
- Homan, K. A., et al. Flow-enhanced vascularization and maturation of kidney organoids in vitro. Nature Methods. 16 (3), 255-262 (2019).
- Trowell, O. A. A modified technique for organ culture in vitro. Experimental Cell Research. 6 (1), 246-248 (1954).
