Summary

Lesión cerebral inducida por láser en la corteza motora de ratas

Published: September 26, 2020
doi:

Summary

El protocolo presentado aquí muestra una técnica para crear un modelo de roedor de lesión cerebral. El método descrito aquí utiliza irradiación láser y apunta a la corteza motora.

Abstract

Una técnica común para inducir accidente cerebrovascular en modelos experimentales de roedores implica la oclusión transitoria (a menudo denotada como MCAO-t) o permanente (designada como MCAO-p) de la arteria cerebral media (MCA) utilizando un catéter. Esta técnica generalmente aceptada, sin embargo, tiene algunas limitaciones, limitando así su uso extensivo. La inducción del accidente cerebrovascular por este método se caracteriza a menudo por una alta variabilidad en la localización y el tamaño del área isquémica, ocurrencias periódicas de hemorragia y altas tasas de mortalidad. Además, la finalización exitosa de cualquiera de los procedimientos transitorios o permanentes requiere experiencia y a menudo dura unos 30 minutos. En este protocolo, se presenta una técnica de irradiación láser que puede servir como un método alternativo para inducir y estudiar lesiones cerebrales en modelos de roedores.

En comparación con las ratas en los grupos de control y MCAO, la lesión cerebral por inducción láser mostró una menor variabilidad en la temperatura corporal, volumen de infarto, edema cerebral, hemorragia intracraneal y mortalidad. Además, el uso de una lesión inducida por láser causó daño a los tejidos cerebrales sólo en la corteza motora a diferencia de los experimentos MCAO donde se observa la destrucción de la corteza motora y los tejidos estriados.

Los resultados de esta investigación sugieren que la irradiación láser podría servir como una técnica alternativa y eficaz para inducir lesiones cerebrales en la corteza motora. El método también acorta el tiempo para completar el procedimiento y no requiere controladores expertos.

Introduction

A nivel mundial, el accidente cerebrovascular es la segunda causa de muerte y la tercera causa principal de discapacidad1. El accidente cerebrovascular también conduce a una discapacidad grave, a menudo requiere atención adicional del personal médico y sus familiares. Por lo tanto, es necesario comprender las complicaciones asociadas con el trastorno y mejorar el potencial de resultados más positivos.

El uso de modelos animales es el primer paso para entender las enfermedades. Para garantizar los mejores resultados de investigación, un modelo típico incluiría una técnica simple, asequibilidad, alta reproducibilidad y variabilidad mínima. Los determinantes en los modelos de accidente cerebrovascular isquémico incluyen el volumen de edema cerebral, el tamaño del infarto, la extensión de la descomposición de la barrera hematoencefálica (BBB) y el deterioro funcional generalmente evaluado a través de la puntuación de gravedad neurológica2.

La técnica de inducción por accidente cerebrovascular más utilizada en modelos de roedores ocluye la arteria cerebral media (MCA) transitoria o permanentemente3. Esta técnica produce un modelo de trazo similar a los de los seres humanos: tiene una penumbra que rodea el área acariciada, es altamente reproducible, y regula la duración de la isquemia y la reperfusión4. Sin embargo, el método MCAO tiene algunas complicaciones. La técnica es propensa a hemorragia intracraneal y lesiones a la retina ipsilateral con una disfunción de la corteza visual y hipertermia común que a menudo conducen a resultados adicionales5,,6,,7. Otras limitaciones incluyen altas variaciones en el accidente cerebrovascular inducido (que surgen de la extensión probable de la isquemia a regiones no deseadas, como la región externa de la arteria carótida), oclusión insuficiente del MCA y reperfusión prematura. Además, las ratas de diferentes cepas y tamaños exhiben varios volúmenes de infarto8. Además de todas las desventajas mencionadas, el modelo MCAO no puede inducir pequeños accidentes cerebrovasculares aislados en áreas cerebrales profundas, ya que está limitado técnicamente en términos de su requisito de tamaño mínimo del recipiente para el cateterismo. Esto hace que la necesidad de un modelo alternativo sea aún más crítica. Otro método, la fototrombosis, proporciona una posible alternativa a los procedimientos MCAO pero no mejora la eficiencia9. Esta técnica apunta a la carrera con la luz y ofrece algunas mejoras en los modelos anteriores. Sin embargo, la fototrombosis requiere una craneotomía invasiva que se asocia con compicaciones secundarias9.

A la luz de las deficiencias esbozadas, el protocolo presentado aquí proporciona una técnica láser alternativa capaz para inducir lesiones cerebrales en roedores. El mecanismo de acción de la técnica láser se basa en los efectos fototérmicos del láser impartidos en tejidos vivos, lo que conduce a la absorción de haces de luz por los tejidos del cuerpo y su conversión en calor. Las ventajas de utilizar una técnica láser son su seguridad y facilidad de manipulación. La capacidad de un láser para producir calor para detener el sangrado lo hace muy importante en la medicina, mientras que su capacidad para amplificar diferentes haces en un punto de encuentro dado asegura que los láseres evitan destruir los tejidos sanos que se interponen en el camino del punto de destino10. El rayo láser utilizado en este protocolo puede pasar a través de un medio líquido bajo, como el hueso, sin emitir su energía y / o causar ninguna destrucción. Una vez que alcanza un medio líquido alto, como los tejidos cerebrales, consume su energía para destruir los tejidos diana. La técnica, por lo tanto, puede inducir lesiones cerebrales sólo en el área apropiada del cerebro.

La técnica presentada aquí mostró una enorme cantidad de capacidad para regular sus niveles de irradiación, produciendo las variaciones elegidas de lesión cerebral previstas desde el principio. A diferencia del MCAO original que afecta tanto a la corteza como al estriado, la técnica láser fue capaz de regular el impacto de la lesión cerebral, induciendo lesiones sólo en la corteza motora prevista. Aquí, se proporciona el protocolo de lesión cerebral inducida por láser y un resumen de los resultados representativos para el procedimiento realizado en la corteza cerebral de ratas.

Protocol

El siguiente procedimiento se llevó a cabo de conformidad con las Directrices para el uso de animales experimentales de la Comunidad Europea. Los experimentos también fueron aprobados por el Comité de Cuidado de Animales en la Universidad Ben-Gurion del Negev. 1. Selección y preparación de animales Seleccione 65 ratas macho Sprague-Dawley que pesen de 300 a 350 g sin patología general para este procedimiento. El tamaño más pequeño plantea dificultades técnicas para el proce…

Representative Results

No se registraron muertes ni SAH ni en el control ni en los grupos experimentales(Tabla 1). El grupo MCAO tenía una tasa del 20% tanto de mortalidad como de SAH. Los cambios relativos de la temperatura corporal en las ratas de ambos grupos también fueron similares, a pesar de una diferencia en la variabilidad de ambos grupos (Tabla 1). Hubo un SEN significativamente peor tanto en los modelos láser (16 x 1,1) como en el MCAO (20 x…

Discussion

Es justo suponer que la técnica láser es mínimamente invasiva, dado que no se produjeron muertes o SAH en el grupo láser. La causa principal de la muerte y la SAH es el daño a los vasos sanguíneos que conduce a una elevación de la presión intracraneal (ICP), como se muestra en las técnicas originales de MCAO10. La ausencia de muerte y SAH en el grupo láser es probable debido a los efectos específicos de los láseres: no tienen impacto directo en los vasos sanguíneos y pueden inducir la…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nos gustaría dar las gracias al Departamento de Anestesiología del Centro Médico de la Universidad de Soroka y al personal de laboratorio de la Universidad Ben-Gurion del Negev por su ayuda en la realización de este experimento.

Materials

2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride SIGMA – ALDRICH 298-96-4
50% trichloroacetic acid SIGMA – ALDRICH 76-03-9
Brain & Tissue Matrices SIGMA – ALDRICH 15013
Cannula Venflon 22 G KD-FIX 1.83604E+11
Centrifuge Sigma 2-16P SIGMA – ALDRICH Sigma 2-16P
Compact Analytical Balances SIGMA – ALDRICH HR-AZ/HR-A
Digital Weighing Scale SIGMA – ALDRICH Rs 4,000
Dissecting scissors SIGMA – ALDRICH Z265969
Eppendorf pipette SIGMA – ALDRICH Z683884
Eppendorf Tube SIGMA – ALDRICH EP0030119460
Ethanol 96 % ROMICAL Flammable Liquid
Evans Blue 2% SIGMA – ALDRICH 314-13-6
Fluorescence detector Tecan, Männedorf Switzerland model Infinite 200 PRO multimode reader
Heater with thermometer Heatingpad-1 Model: HEATINGPAD-1/2
Infusion Cuff ABN IC-500
Isofluran, USP 100% Piramamal Critical Care, Inc NDC 66794-017
Multiset TEVA MEDICAL 998702
Olympus BX 40 microscope Olympus
Optical scanner Canon Cano Scan 4200F
Petri dishes SIGMA – ALDRICH P5606
Scalpel blades 11 SIGMA – ALDRICH S2771
Sharplan 3000 Nd:YAG (neodymium-doped yttrium aluminum garnet) laser machine Laser Industries Ltd
Stereotaxic head holder KOPF 900LS
Sterile Syringe 2 ml Braun 4606027V
Syringe-needle 27 G Braun 305620

Referencias

  1. World Health Organization. Global health estimates: deaths by cause, age, sex and country, 2000-2012. World Health Organization. 9, (2014).
  2. Meadows, K. L. Experimental models of focal and multifocal cerebral ischemia: a review. Reviews in the Neurosciences. 29, 661-674 (2018).
  3. Durukan, A., Strbian, D., Tatlisumak, T. Rodent models of ischemic stroke: a useful tool for stroke drug development. Current Pharmaceutical Designs. 14, 359-370 (2008).
  4. Fluri, F., Schuhmann, M. K., Kleinschnitz, C. Animal models of ischemic stroke and their application in clinical research. Drug Design, Development and Therapy. 9, 3445-3454 (2015).
  5. Li, F., Omae, T., Fisher, M. Spontaneous hyperthermia and its mechanism in the intraluminal suture middle cerebral artery occlusion model of rats. Stroke. 30, 2464-2470 (1999).
  6. Boyko, M., et al. An experimental model of focal ischemia using an internal carotid artery approach. Journal of Neuroscience Methods. 193, 246-253 (2010).
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  8. Braeuninger, S., Kleinschnitz, C. Rodent models of focal cerebral ischemia: procedural pitfalls and translational problems. Experimental and Translational Stroke Medicine. 1, 8 (2009).
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  10. Boyko, M., et al. An Alternative Model of Laser-Induced Stroke in the Motor Cortex of Rats. Biological Procedure Online. 21, 9 (2019).
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  13. Boyko, M., et al. Morphological and neuro-behavioral parallels in the rat model of stroke. Behavioural Brain Research. 223, 17-23 (2011).

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Citar este artículo
Kuts, R., Melamed, I., Shiyntum, H. N., Gruenbaum, B. F., Frank, D., Knyazer, B., Natanel, D., Severynovska, O., Vinokur, M., Boyko, M. Laser-Induced Brain Injury in the Motor Cortex of Rats. J. Vis. Exp. (163), e60928, doi:10.3791/60928 (2020).

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