Einfache Lithographie-freie Einzelzell-Mikromusterung mit Laser-Cut Schablonen
Summary
Dieses Protokoll führt eine lithographiefreie Mikromustermethode ein, die einfach und zugänglich für Personen mit einem begrenzten Bioengineering-Hintergrund ist. Diese Methode verwendet maßgeschneiderte lasergeschnittene Schablonen, um extrazelluläre Matrixproteine in einer Form von Interesse für die Modulation von Zellmorphologien mikromustern zu lassen. Das Verfahren zur Mikromusterung wird mit induzierten pluripotenten Stammzellabgeleiteten Kardiomyozyten demonstriert.
Abstract
Mikromustertechniken wurden in der Zellbiologie weit verbreitet, um die Auswirkungen der Kontrolle der Zellform und -größe auf die Bestimmung des Zellschicksals bei Einzelzellauflösung zu untersuchen. Aktuelle, hochmoderne Einzelzell-Mikromustertechniken beinhalten weiche Lithographie und Mikrokontaktdruck, eine leistungsfähige Technologie, erfordert jedoch geschulte Ingenieurskunst und eine gewisse Unterstützung in der Mikrofertigung. Diese Einschränkungen erfordern eine leichter zugängliche Technik. Hier beschreiben wir eine einfache alternative lithographiefreie Methode: schablonenbasierte Einzelzellmusterung. Wir bieten Schritt-für-Schritt-Verfahren wie Schablonendesign, Polyacrylamid-Hydrogel-Fertigung, Schablonen-basierte Protein-Inkorporation, zell-plating und Kultur. Diese einfache Methode kann verwendet werden, um ein Array von bis zu 2.000 Zellen zu modellieren. Wir zeigen die Musterung von Kardiomyozyten, die aus einzelnen menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSC) mit unterschiedlichen Zellformen abgeleitet werden, von einem 1:1-Quadrat bis zu einem 7:1-Erwachsenen-Kardiomyozyten-ähnlichen Rechteck. Diese schablonenbasierte Einzelzellmusterung ist lithographiefrei, technisch robust, bequem, kostengünstig und vor allem für Personen mit eingeschränktem Bioengineering-Hintergrund zugänglich.
Introduction
Das Aufkommen von hiPSCs und die anschließende Entwicklung von Protokollen für ihre gezielte Differenzierung in verschiedene Zelltypen haben es ermöglicht, Entwicklung und Krankheit auf molekularer und patientenspezifischer Ebene zu untersuchen, insbesondere mit patientenabgeleiteten iPSC-Kardiomyozyten (iPSC-CMs) zur Modellierung von Kardiomyopathien1,2. Eine wesentliche Einschränkung für das Studium der Entwicklung und Physiologie mit dem iPSC-System und anderen In-vitro-Modellen ist jedoch das Fehlen einer strukturierten Mikroumgebung. In situ werden Zellen den Einschränkungen der extrazellulären Matrix (ECM) sowie benachbarten Zellen unterworfen. Die besondere biochemische Zusammensetzung und Steifigkeit dieser Mikroumgebungen bestimmen die räumliche Verteilung der Zellen sowie die verfügbaren Faktoren für die Zellhaftung. Dies wiederum beeinflusst intrazelluläre Signalwege, Genexpression und Zellschicksalsbestimmung. Zum Beispiel hat mikrogemusterte iPSC-CM in einer erwachsenen-ähnlichen Stabform eine deutlich bessere Kontraktilität, Kalziumfluss, mitochondriale Organisation, Elektrophysiologie und Quer-Tubule-Bildung3. Somit sind die Eigenschaften der Mikroumgebung integraler Bestandteil der Regulierung zellulärer Funktionen.
Frühere Mikromustertechniken stützten sich stark auf die Photolithographie (Abbildung 1A). Bei dieser Technik wird eine Schicht aus lichtempfindlichem Polymer oder Photoresist auf einem flachen Substrat aus der Lösung gesponnen, um einen dünnen Film zu bilden, der etwa 1 m dick ist. Als nächstes wird ultraviolettes (UV) Licht durch eine Maske, die das gewünschte Muster enthält, auf den Photoresist aufgetragen. Die Exposition gegenüber ultraviolettem (UV) Licht verändert den Photowiderstand chemisch, indem er seine Löslichkeit in der jeweiligen Entwicklerlösung ändert und das gewünschte Muster von der Maske auf das Substrat überträgt. Viele Mikromustermethoden beinhalten photolithographie, da sie Nanometer-Mikrometer-Ebene Kontrolle über die Gestaltung der Zellmuster verleiht. Das Spinnen des Photoresists ist jedoch sehr empfindlich gegenüber Verunreinigungen, da die kleinsten Staubpartikel die Ausbreitung der Lösung in einen dünnen Film stören. Die Photolithographie muss daher in nicht kontaminierten Anlagen durchgeführt werden, die kostspielig zu warten sind und besondere Fachkenntnisse erfordern. Darüber hinaus sind die in der Photolithographie verwendeten Chemikalien oft toxisch für Zellen und können wichtige Biomoleküle denaturieren. Die Photolithographie stellt somit erhebliche Hindernisse für die Herstellung von Mikromustern für bequeme biologische Anwendungen dar.
1994 meisterte Whitesides und Kollegen4 einige der Herausforderungen im Zusammenhang mit der Photolithographie, indem sie eine Sammlung von Techniken namens Soft Lithographie voranbringen. In der weichen Lithographie wird eine mikrostrukturierte Oberfläche aus Polydimethylsiloxan (PDMS), einem transparenten, gummiähnlichen Material, verwendet, um ein Muster von ECM-Proteinen4zu erzeugen. Häufige Soft-Lithographie-Techniken umfassen Mikrokontaktdruck und mikrofluidische Musterung. Im Mikrokontaktdruck, der derzeit beliebtesten Softlithographie-Methode, überträgt ein mit ECM-Proteinen beschichteter PDMS-Stempel das Material auf eine Oberfläche an den durch den Stempel kontaktierten Bereichen (Abbildung 1B). In der mikrofluidischen Musterung werden Mikrostrukturen auf einer PDMS-Oberfläche so konstruiert, dass beim Drücken des Stempels auf ein Substrat ein Netzwerk von Mikrokanälen entsteht, durch das Flüssigkeiten in gewünschte Bereiche geliefert werden können (Abbildung 1C)5. Weiche Lithographie bietet mehrere Vorteile gegenüber der Photolithographie. Sobald ein Master-Wafer mikrofabriziert ist, können die PDMS-Stempel ohne weiteren Einsatz von Reinraumanlagen einfach repliziert werden. Darüber hinaus ermöglicht das Fehlen organischer Lösungsmittel im Prozess der weichen Lithographie die Verwendung von polymeren Materialien wie Polystyrol, das typischerweise in der Zellkultur verwendet wird. Schließlich ist die Mikromusterung mit weichen lithographischen Methoden nicht auf flache Oberflächen beschränkt. So erhöht die weiche Lithographie die Zugänglichkeit und Funktionalität der Mikromusterfertigung gegenüber der Photolithographie6. Die weiche Lithographie hat jedoch erhebliche Nachteile. Zum Beispiel ist ein erster Ätzschritt mit Hilfe der Photolithographie immer noch erforderlich, um den Stempel mikrofabrizieren zu können. Darüber hinaus unterliegt die Mikromusterung mit einem PDMS-Stempel Schwankungen in der Qualität des Proteintransfers auf das Substrat6. Um diese Diskrepanzen zu vermeiden, ist eine Optimierung und Konsistenz des Drucks erforderlich, der während des Proteintransfers auf den PDMS-Stempel ausgeübt wird, da sonst Verformungen und Verzerrungen der Merkmalsgrößen der PDMS-Formen auftreten können6. Es gibt auch ein großes Problem der wiederholten Verwendung des PDMS aufgrund der kleinen Molekülabsorption7.
Um die Verwendung weicher Photolithographie und PDMS-Stempel zu vermeiden, beschreiben wir eine schablonenbasierte, lithographiefreie Einzelzell-Mikromustermethode, die viele der Hindernisse im Zusammenhang mit Photolithographie und weicher Lithographie überwindet. Bei diesem Verfahren wird ein Polyacrylamidhydrogel als Substrat für die Verwendung von ECM-Protein auf Schablonenbasis verwendet, was eine selektive Beschichtung einzelner hiPSC-CMs ermöglicht. Diese Technik ist hochkompatibel mit polymeren Materialien, die in klassischen Zellkulturbedingungen verwendet werden. Darüber hinaus sind die Schablonen bei ordnungsgemäßer Reinigung und Wartung wiederverwendbar und resistent gegen Abbau und Proteinabsorption während des Mikroherstellungsprozesses. Schließlich ist der Musterprozess technisch robust, kostengünstig, anpassbar und zugänglich für diejenigen ohne spezialisierte Bioengineering-Fähigkeiten. Diese schablonenbasierte Mikromustertechnik wurde in unseren jüngsten Veröffentlichungen zur Modellierung verschiedener Kardiomyopathien8,9,10breite Nutzungen erzielt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wir beschreiben eine lithographiefreie, schablonenbasierte Mikromustermethode, die eine effektive Musterung von anhaftenden Zellen ermöglicht. In diesem Protokoll zeigen wir die Musterung von hiPSC-CMs in unterschiedlichen Längen-Breiten-Verhältnissen durch Mikromusterung von Kellermembran-Matrix-Proteininseln auf Polyacrylamid-Hydrogelen mit physiologisch- oder pathologisch relevanten Gewebesteifigkeiten oder siliziumbasierten Elastomersubstraten. Diese Methode ist relativ einfach und für alle Forscher sehr zugängl…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch ein Postdoktorandenstipendium des Stanford Child Health Research Institute (CHRI) und des National Institute of Health (1F32HL142205-01) an S.L. nIH Office of Director es Pioneer Award (LM012179-03), den American Heart Association Established Investigator Award (17EIA33410923), das Stanford Cardiovascular Institute, die Hoffmann and Schroepfer Foundation und die Stanford Division of Cardiovascular Medicine, Department of Medicine to S.M.W , Auszeichnungen des National Institute of Health (UG3 TR002588, P01 HL141084, R01 HL126527, R01 HL113006, R01 HL123968) and Tobacco-related Disease Research Program (TRDRP 27IR-0012) an J.C.W, den American Heart Association (AHA) Postdoctoral Fellowship Award (18POST34030106) an H.Y. und das Hengstberger-Stipendium an T.S. Wir danken Dr. Andrew Olsen vom Stanford Neuroscience Microscopy Service für die Unterstützung der konfokalen Bildgebung des mikropatterned hiPSC-CM. Wir danken H.Y. für das erste Schablonendesign, die Herstellung, die einzelzellige Mikromusterung von iPSC-CM auf dem polyacrylamidhydrogelbeschichteten Deckelschlupf und die vorläufige konfokale Abbildung der Sarcomere-Struktur von einzellig mikrogemusterten iPSC-CMs.
Materials
| 2-Aminoethyl methacrylate hydrochloride (powder) | Sigma-Aldrich | 516155 | |
| Acrylamide solution 40% (solution) | Sigma-Aldrich | A-4058-100mL | |
| Bench UV lamp 365 nm | UVP | UVP 95-0042-07, XX-15L | |
| BioFlex culture plate | FLEXCELL INTERNATIONAL CORPORATION, Burlington, NC | 6-well plate with silicon elastomer substrate | |
| Bis-acrylamide solution 2% (solution) | Sigma-Aldrich | M1533-25mL | |
| Corning cover glasses square, No. 2, W × L 22 mm × 22 mm | Sigma | CLS285522 | |
| Irgacure (2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone) (powder) | Sigma-Aldrich | 410896 | |
| Matrigel | Corning | 356231 | basement membrane matrix protein solution |
| Methyl sulfoxide, 99.7+%, Extra Dry, AcroSeal, ACROS Organics | Acros Organics | 326881000 | |
| Millex (13mm) filter unit with Durapore Membrane | Millipore | SLGV013SL | |
| Millipore 50mL Steriflip (0.22 µm) | Fisher Scientific | SCGP00525 | |
| Stencils | Potomac | custom design | |
| Sulfo-SANPAH | ThermoFisher Scientific | 22589 | |
| TrypLE Select 10x | ThermoFisher Scientific | A1217702 | Enzyme used for stencil cleaning |
Referencias
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