Lazer Kesim Şablonlar Kullanılarak Basit Litografisiz Tek Hücreli Mikrodesenleme
Summary
Bu protokol, sınırlı biyomühendislik geçmişi olanlar için basit ve erişilebilir bir litografi içermeyen mikrodesenleme yöntemini tanıtır. Bu yöntem, hücre morfolojilerini modüle etmek için ilgi çekici bir şekilde hücre dışı matris proteinleri mikrodesen için özelleştirilmiş lazer kesim şablonlar kullanır. Mikro desenleme prosedürü indüklenmiş pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyositler kullanılarak gösterilmiştir.
Abstract
Mikro desenleme teknikleri hücre biyolojisinde hücre şekil ve boyutunu kontrol eden etkilerin tek hücre çözünürlüğünde hücre kader intibakları üzerine etkisini incelemek için yaygın olarak kullanılmıştır. Mevcut state-of-the-art tek hücreli mikrodesen teknikleri yumuşak litografi ve mikro temas baskı, güçlü bir teknolojidir içerir, ancak mikrofabrikasyon eğitimli mühendislik becerileri ve belirli tesis desteği gerektirir. Bu sınırlamalar daha erişilebilir bir teknik gerektirir. Burada basit bir alternatif litografisiz yöntemi tanımlıyoruz: şablon bazlı tek hücreli desenleme. Biz şablon tasarımı, poliakrilamid hidrojel imalatı, şablon bazlı protein birleşme ve hücre kaplama ve kültür dahil olmak üzere adım adım prosedürleri sağlar. Bu basit yöntem, 2.000 kadar hücreden oluşan bir diziyi desenlemek için kullanılabilir. 1:1 kareden 7:1 erişkin kardiyomiyosit benzeri dikdörtgeniçin farklı hücre şekillerine sahip tek bir insan kaynaklı pluripotent kök hücreden (hiPSC) elde edilen kardiyomiyositlerin desenlenmelerini gösteriyoruz. Bu şablon tabanlı tek hücre lisali, litografisiz, teknik olarak sağlam, kullanışlı, ucuz ve en önemlisi sınırlı biyomühendislik geçmişi olanlar için erişilebilir.
Introduction
HiPSCs gelişiyle ve farklı hücre tipleri içine yönlendirilmiş farklılaşma için protokollerin sonraki gelişimi mümkün moleküler ve hastaya özgü düzeyde, özellikle hasta kaynaklı iPSC kardiyomiyositler kullanarak (iPSC-CMs) modelleme kardiyomiyopatiler1,2yaptık . Ancak, iPSC sistemi ve diğer in vitro modelleri kullanarak geliştirme ve fizyoloji eğitimi için önemli bir sınırlama yapılandırılmış bir mikroortamın yokluğudur. Yerinde, hücreler hücre dışı matris (ECM) kısıtlamaları yanı sıra komşu hücrelere tabi tutulur. Bu mikroortamların belirli biyokimyasal bileşimi ve sertliği, hücrelerin mekansal dağılımını ve hücre yapışmasını için mevcut faktörleri belirler. Bu da hücre içi sinyal yollarını, gen ekspresyonunu ve hücre kaderinin belirlenmesini etkiler. Örneğin, yetişkin benzeri çubuk şeklinde mikro desenli iPSC-CM önemli ölçüde daha iyi kontraktil yeteneği vardır, kalsiyum akışı, mitokondriyal organizasyon, elektrofizyoloji, ve enine-tübül oluşumu3. Bu nedenle, mikroçevrenin özellikleri hücresel fonksiyonların düzenlenmesinde ayrılmaz bir parçasıdır.
Önceki mikrodesenleme teknikleri yoğun olarak fotolitografiye dayanıyordu (Şekil 1A). Bu teknikte, ışığa duyarlı polimer veya fotodirenç tabakası, çözeltiden düz bir substrat üzerinde yaklaşık 1 μm kalınlığında ince bir film oluşturmak için döndürüldü. Daha sonra, ultraviyole (UV) ışık istenilen desen içeren bir maske ile fotodirenç üzerine uygulanır. Ultraviyole (UV) ışığa maruz kalma, ilgili geliştirici çözümündeki çözünürlüğünü değiştirerek fotodirenç’i kimyasal olarak değiştirir ve maskeden istenilen deseni alt tabakaya aktarabilir. Birçok mikrodesenleme yöntemi fotolitografiiçerir, çünkü hücre desenlerinin tasarımı üzerinde mikrometre düzeyinde kontrol sağlar. Ancak, fotodirenç iplik kirleri son derece duyarlıdır, küçük toz parçacıkları ince bir film içine çözeltinin yayılmasını bozacak çünkü. Bu nedenle fotolitografi, bakımı maliyetli ve kullanımı özel uzmanlık gerektiren kirlenmemiş tesislerde yapılmalıdır. Buna ek olarak, fotolitografide kullanılan kimyasallar genellikle hücreler için toksiktir ve önemli biyomoleküllerden doğaartabilir. Bu nedenle fotolitografi, uygun biyolojik uygulamalar için mikro desenlerin üretilmesinde önemli engeller oluşturmaktadır.
1994’te Whitesides ve meslektaşları4, yumuşak litografi adı verilen bir teknik koleksiyonuna öncülük ederek fotolitografi ile ilgili bazı zorlukların üstesinden geldiler. Yumuşak litografide, şeffaf, kauçuk benzeri bir malzeme olan polidimethylsiloxane (PDMS) ile yapılan mikroyapılı yüzey, ECM proteinlerinin bir deseni oluşturmak için kullanılır4. Yaygın yumuşak litografik teknikler mikrotemas baskı ve mikroakışkan deseniçerir. Şu anda en popüler yumuşak litografik yöntem olan mikrotemaslı baskıda, ECM proteinleri ile kaplanmış bir PDMS damgası, malzemeyi damganın temas ettiği alanlardaki bir yüzeye aktarır(Şekil 1B). Mikroakışkan desenlemede mikroyapılar, pul bir alt tabakaya basıldığında, sıvıların istenilen alanlara ulaştırılabildiği bir mikrokanal ağı oluşturulacak şekilde PDMS yüzeyinde tasarlanır (Şekil 1C)5. Yumuşak litografi fotolitografi üzerinde çeşitli faydalar sunar. Bir kez ana gofret mikrofabrikasyon, PDMS pulları kolayca temiz oda tesisleri daha fazla istihdam olmadan çoğaltılabilir. Buna ek olarak, yumuşak litografi sürecinde organik çözücülerin yokluğu genellikle hücre kültüründe kullanılan polistiren gibi polimerik malzemelerin kullanımına olanak sağlar. Son olarak, yumuşak litografik yöntemler kullanılarak mikrodesen düz yüzeyler ile sınırlı değildir. Böylece yumuşak litografi, mikrodesen üretiminin fotolitografi 6’ya göre6erişilebilirliğini ve işlevselliğini arttırmaktadır. Ancak, yumuşak litografi önemli dezavantajları vardır. Örneğin, fotolitografi kullanarak bir ilk gravür adımı, hala damga mikrofabrikasyon için gereklidir. Buna ek olarak, bir PDMS damgası kullanarak mikrodesen substrat üzerine protein transferi kalitesinde farklılıklar tabidir6. Bu tutarsızlıklardan kaçınmak, protein transferi sırasında PDMS damgasına uygulanan basınçta optimizasyon ve tutarlılık gerektirir, aksi takdirde PDMS kalıplarının özellik boyutlarının deformasyonu ve bozulması6. Küçük molekül emilimi nedeniyle tekrar tekrar PDMS kullanarak önemli bir endişe de vardır7.
Yumuşak fotolitografi ve PDMS pulları kullanmaktan kaçınmak için, fotolitografi ve yumuşak litografi ile ilişkili engellerin çoğunu aşan şablon tabanlı, litografiiçermeyen tek hücreli mikrodesenleme yöntemini tanımlıyoruz. Bu yöntemde, bir poliakrilamid hidrojel şablon bazlı ECM protein dahil için bir substrat olarak kullanılır, tek hiPSC-CMs seçici kaplama için izin. Bu teknik klasik hücre kültürü koşullarında kullanılan polimerik malzemeler ile son derece uyumludur. Ayrıca, uygun temizlik ve bakım ile, şablonlar yeniden kullanılabilir ve mikrofabrikasyon işlemi sırasında bozulma ve protein emilimine karşı dayanıklıdır. Son olarak, desenleme işlemi teknik olarak sağlam, ucuz, özelleştirilebilir ve özel biyomühendislik becerileri olmayanlar için erişilebilir. Bu şablon bazlı mikro desenleme tekniği, çeşitli kardiyomiyopatilerinmodelli8,9,10.
Protocol
Representative Results
Discussion
Yapışık hücrelerin etkili desenlemesini sağlayan litografiiçermeyen şablon bazlı mikro desenleme yöntemini tanımlıyoruz. Bu protokolde, fizyolojik veya patolojik olarak ilgili doku sertlikleri veya silikon bazlı elastomer substratları ile poliakrilamid hidrojeller üzerinde mikrodesenli bazal membran matris protein adaları mikrodesenleme tarafından farklı uzunluk-genişlik oranlarında hiPSC-CMs desenleme göstermektedir. Bu yöntem, fotolitografi ve mikrofabrikasyon teknikleri konusunda çok az geçmişe…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Stanford Çocuk Sağlığı Araştırma Enstitüsü (CHRI) ve Ulusal Sağlık Enstitüsü’nden (1F32HL142205-01) S.L.’ye doktora sonrası burs ile desteklenmiştir. NIH Direktör Öncü Ödülü Ofisi (LM012179-03), Amerikan Kalp Derneği Araştırmacı Ödülü (17EIA33410923), Stanford Kardiyovasküler Enstitüsü, Hoffmann ve Schroepfer Vakfı ve Stanford Kardiyovasküler Tıp Bölümü, S.M.W. Tıp Bölümü , Ulusal Sağlık Enstitüsü’nden ödüller (UG3 TR002588, P01 HL141084, R01 HL126527, R01 HL113006, R01 HL123968) ve Tütünle ilgili Hastalık Araştırma Programı (TRDRP 27IR-0012) J.C.W,Amerikan Kalp Derneği (AHA) Doktora Sonrası Burs Ödülü (18POST34030106) H.Y ve Henbergergstgst bursu.T.T.’ye. Stanford Nörobilim Mikroskopi Servisi’nden Dr. Andrew Olsen’e mikrodesenli hiPSC-CM konfokal görüntüleme desteği için teşekkür ederiz. H.Y.’ye ilk şablon tasarımı, imalatı, poliakrilamid hidrojel kaplı kapak üzerinde iPSC-CM’nin tek hücreli mikrodesenlenmesi ve tek hücreli mikrodesenli iPSC-CM’lerin sarcomere yapısının ön konfokal görüntülemesi için teşekkür ederiz.
Materials
| 2-Aminoethyl methacrylate hydrochloride (powder) | Sigma-Aldrich | 516155 | |
| Acrylamide solution 40% (solution) | Sigma-Aldrich | A-4058-100mL | |
| Bench UV lamp 365 nm | UVP | UVP 95-0042-07, XX-15L | |
| BioFlex culture plate | FLEXCELL INTERNATIONAL CORPORATION, Burlington, NC | 6-well plate with silicon elastomer substrate | |
| Bis-acrylamide solution 2% (solution) | Sigma-Aldrich | M1533-25mL | |
| Corning cover glasses square, No. 2, W × L 22 mm × 22 mm | Sigma | CLS285522 | |
| Irgacure (2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone) (powder) | Sigma-Aldrich | 410896 | |
| Matrigel | Corning | 356231 | basement membrane matrix protein solution |
| Methyl sulfoxide, 99.7+%, Extra Dry, AcroSeal, ACROS Organics | Acros Organics | 326881000 | |
| Millex (13mm) filter unit with Durapore Membrane | Millipore | SLGV013SL | |
| Millipore 50mL Steriflip (0.22 µm) | Fisher Scientific | SCGP00525 | |
| Stencils | Potomac | custom design | |
| Sulfo-SANPAH | ThermoFisher Scientific | 22589 | |
| TrypLE Select 10x | ThermoFisher Scientific | A1217702 | Enzyme used for stencil cleaning |
Referencias
- Burridge, P. W., et al. Chemically Defined and Small Molecule-Based Generation of Human Cardiomyocytes. Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
- Sayed, N., Liu, C., Wu, J. C. Translation of Human-Induced Pluripotent Stem Cells: From Clinical Trial in a Dish to Precision Medicine. Journal of the American College of Cardiology. 67 (18), 2161-2176 (2016).
- Ribeiro, A. J. S., et al. Contractility of single cardiomyocytes differentiated from pluripotent stem cells depends on physiological shape and substrate stiffness. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (41), 12705-12710 (2015).
- Kumar, A., Biebuyck, H. A., Whitesides, G. M. Patterning Self-Assembled Monolayers: Applications in Materials Science. Langmuir. 10 (5), 1498-1511 (1994).
- Wilbur, J. L., Kumar, A., Kim, E., Whitesides, G. M. Microfabrication by microcontact printing of self-assembled monolayers. Advanced Materials. 6 (7-8), 600-604 (1994).
- Théry, M. Micropatterning as a tool to decipher cell morphogenesis and functions. Journal of Cell Science. 123 (24), 4201-4213 (2010).
- Toepke, M. W., Beebe, D. J. PDMS absorption of small molecules and consequences in microfluidic applications. Lab on a Chip. 6 (12), 1484-1486 (2006).
- Seeger, T., et al. A Premature Termination Codon Mutation in MYBPC3 Causes Hypertrophic Cardiomyopathy via Chronic Activation of Nonsense-Mediated Decay. Circulation. 139 (6), 799-811 (2019).
- Lee, J., et al. Activation of PDGF pathway links LMNA mutation to dilated cardiomyopathy. Nature. 572 (7769), 335-340 (2019).
- Wu, H., et al. Modelling diastolic dysfunction in induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes from hypertrophic cardiomyopathy patients. European Heart Journal. 40 (45), 3685-3695 (2019).
- Fischer, R. S., Myers, K. A., Gardel, M. L., Waterman, C. M. Stiffness-controlled three-dimensional extracellular matrices for high-resolution imaging of cell behavior. Nature Protocols. 7 (11), 2056-2066 (2012).
- Lee, S., Stanton, A. E., Tong, X., Yang, F. Hydrogels with enhanced protein conjugation efficiency reveal stiffness-induced YAP localization in stem cells depends on biochemical cues. Biomaterials. 202, 26-34 (2019).
- Théry, M., Pépin, A., Dressaire, E., Chen, Y., Bornens, M. Cell distribution of stress fibres in response to the geometry of the adhesive environment. Cell Motility. 63 (6), 341-355 (2006).
- Kilian, K. A., Bugarija, B., Lahn, B. T., Mrksich, M. Geometric cues for directing the differentiation of mesenchymal stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (11), 4872-4877 (2010).
