Ensayo de adhesión a Opsono para evaluar anticuerpos funcionales en el desarrollo de vacunas contra la antrasis bacillus y otros patógenos encapsulados

El reconocimiento, la adherencia, la internalización y la degradación de un patógeno son parte integral de la fagocitosis^1,una vía destacada en la respuesta inmune innata huésped descrita por primera vez por Ilya Metchnikoff en 1883^2,3. Los leucocitos fagocíticos, así como otras células del sistema inmunitario, son altamente discriminatorios en su selección de objetivos; son capaces de distinguir entre “yo infeccioso” y “yo no infeccioso” a través de patrones moleculares asociados a patógenos por su repertorio de receptores de reconocimiento de patrones (PRR)^4,5. El reconocimiento del huésped de un patógeno también puede producirse con la unión de opsoninas huésped, como complemento y anticuerpos^6. Este proceso, llamado opsonización, recubre el patógeno con estas moléculas, mejorando la internalización al unirse a los receptores opsónicos (por ejemplo, complemento y receptores Fc) en las células fagocíticas^6. Para que un patógeno se adhiera a un fagocito, es necesaria la unión colectiva de múltiples receptores con sus ligandos de cognado. Sólo entonces la adherencia puede activar y sostener cascadas de señalización dentro de la celda host para iniciar la internalización⁶.

Debido a la importancia de la fagocitosis en el aclaramiento de patógenos y la prevención de infecciones, patógenos extracelulares han desarrollado numerosas maneras de subvertir este proceso para prolongar su supervivencia. Una estrategia de importancia es la producción de una cápsula polimérica aniónica (por ejemplo, polisacárido o poliaminoácido) que es anti-fagocítica en virtud de su carga, es poco inmunogénica, y protege moléculas en la envolvente bacteriana de los PRR^6,7. Patógenos como Cryptococcus neoformans y Streptococcus pneumoniae tienen cápsulas compuestas de polímeros de sacárido, mientras que Staphylococcus epidermidis y algunas especies de Bacillus producen ácido poli-ɣ-glutámico (PGGA)^7,8. Sin embargo, otros patógenos producen cápsulas que se asemejan al yo no infeccioso. Por ejemplo, Streptococcus pyogenes y una cepa patógena de B. cereus tienen una cápsula de ácido hialurónico que no sólo es anti-fagocítica, sino que también puede no ser reconocido como extraño por el sistema inmune^9,10.

La conjugación de proteínas portadoras de cápsulas las convierte de antígenos pobres e independientes de T en antígenos altamente inmunogénicos dependientes de la T que pueden inducir títulos de anticuerpos anti-cápsula séricos altos^11,12. Esta estrategia se emplea para vacunas autorizadas contra S. pneumoniae, Haemophilus influenzaey Neisseria meningitides¹¹. Las actividades opsónicas de anticuerpos anti-cápsula han sido comúnmente evaluadas por ensayos de matanza opsono-fagocítica (OPKA)^13,14,15,16. Estos ensayos prueban si los anticuerpos funcionales pueden desencadenar fagocitosis y matar^{a 14.} Sin embargo, el uso de OPKA con patógenos infecciosos, como agentes biológicos selectos de nivel 1 y toxinas (BSAT), incluido B. anthracis^17,es peligroso y presenta riesgos para la seguridad; estos ensayos requieren un manejo exhaustivo de un agente selecto. El manejo de agentes seleccionados solo se puede realizar en laboratorios restringidos de bioseguridad nivel 3 (BSL-3); el trabajo en estas áreas exige procedimientos operativos prolongados debido a las numerosas precauciones de seguridad que deben seguirse. Los laboratorios BSL-3 tampoco suelen estar equipados con el equipo especializado utilizado para el trabajo opka, como microscopios y citómetros. Así, desarrollamos un ensayo alternativo basado en el uso de bacterias inactivadas^18,19. Nos referimos a esto como un ensayo de opsono-adherencia (OAA) que no depende de la internalización y la eliminación de las salidas de ensayo; en su lugar, la adherencia de patógenos inactivados osonizados se utiliza como un índice de fagocitosis. Mecanicistamente, OAA es un sustituto adecuado porque la adherencia ocurre a priori y está íntimamente entrelazada con la internalización y la matanza intracelular. Desde una perspectiva de bioseguridad, OAA es preferible porque requiere un manejo mínimo de un agente infeccioso, es experimentalmente de menor duración que OPKA, y se puede realizar en laboratorios BSL-2 después de que se haya producido y transferido un stock del patógeno inactivado.

Demostramos la utilización de OAA para examinar la función opsónica de anticuerpos anti-cápsula que se encuentran en el sera de primates no humanos (NHP) vacunados con una cápsula conjugada [es decir, PGGA de B. anthracis conjugada al complejo proteico de membrana externa (OMPC) de Meningitidas Neisseria]²⁰. Bacilos osonizados séricos fueron incubados con una línea celular de macrófago de ratón adherente, RAW 264.7. Después de la fijación, la monocapa celular y el bacilo adherente fueron imagenados por microscopía de fluorescencia. La adherencia bacteriana aumentó cuando los bacilos fueron incubados con suero de los NHP vacunados con la cápsula conjugada en comparación con el control sérico^20. Adherencia correlacionada con la supervivencia del desafío de ántrax^20,21. Por lo tanto, el uso de OAA caracterizó la función de los anticuerpos anti-cápsula y facilitó en gran medida las pruebas de nuestro candidato a la vacuna.