En samkulturmetod för att studera neurite utväxt som svar på dentalmassa paracrine signaler
Summary
Vi beskriver isolering, spridning och plätering av tandmassa (DP) primära celler med trigeminal (TG) nervceller odlade ovanpå överliggande transwell filter. Cellulära svar av DP-celler kan analyseras med immunofluorescens eller RNA/proteinanalys. Immunofluorescens av neuronala markörer med konfokal mikroskopi tillåter analys av neurite utväxt svar.
Abstract
Tand innervation tillåter tänder att känna av tryck, temperatur och inflammation, som alla är avgörande för användning och underhåll av tandorganet. Utan sensorisk innervation, dagliga muntliga aktiviteter skulle orsaka irreparabel skada. Trots dess betydelse har rollerna för inre vation i tandutveckling och underhåll till stor del förbisetts. Flera studier har visat att DP-celler utsöndrar extracellulära matrisproteiner och paracrine signaler för att locka och vägleda TG axoner till och i hela tanden. Men få studier har gett detaljerad insikt i tvärsnittet mellan DP mesenchyme och neuronal afferents. För att ta itu med denna klyfta i kunskap, forskare har börjat utnyttja samkulturer och en mängd olika tekniker för att undersöka dessa interaktioner. Här visar vi flera steg som är inblandade i co-odling primära DP celler med TG nervceller spridda på en överliggande transwell filter med stor diameter porer för att möjliggöra axonal tillväxt genom porerna. Primära DP-celler med genav intresse flankerad av loxP platser användes för att underlätta genborttagning med hjälp av en Adenovirus-Cre-GFP rekombinas system. Använda TG nervceller från Thy1-YFP musen tillåtet för exakt afferent imaging, med uttryck långt över bakgrundsnivåer genom konfokal mikroskopi. DP-svaren kan undersökas via protein- eller RNA-insamling och analys, eller alternativt genom immunfluorescerande färgning av DP-celler som pärperats på avtagbara glastäcke. Media kan analyseras med hjälp av tekniker som proteomiska analyser, även om detta kommer att kräva albumin utarmning på grund av förekomsten av fetala nötkreatur serum i media. Detta protokoll ger en enkel metod som kan manipuleras för att studera morfologiska, genetiska och cytoskeletala svar av TG nervceller och DP-celler som svar på den kontrollerade miljön i en samkultur analys.
Introduction
Tand innervation tillåter tänder att känna av tryck, temperatur och inflammation, som alla är avgörande för användning och underhåll av tandorganet. Underlåtenhet att känna tandsmärta i samband med karies och trauma leder till sjukdomsprogression. Således är korrekt innervation ett krav för normal tandtillväxt, funktion och vård.
Medan de flesta organ är fullt fungerande och innervated vid tidpunkten för födseln, tandutveckling sträcker sig in i vuxenlivet, med tand innervation och mineralisering förekommer i samförstånd under postnatal stadier1,2. Intressant nog utsöndrar tandmassa (DP) mesenchyme inledningsvis stöter bort vinklingsignaler under embryogenesis för att förhindra axoninträde i det utvecklande tandorganet, som senare skiftar till utsöndringen av attractantfaktorer som tanden närmar sig utbrott3,4. Under postnatal stadier, afferent axons från trigeminal (TG) nerv tränger in i och hela tanden runt tiden dentin nedfall börjar (ses över i Pagella, P. et al.5). Flera in vivo studier har visat att neuronal-mesenchymal interaktioner vägleda tand innervation hos möss (ses över i Luukko, K. et al.6), men få detaljer om de molekylära mekanismerna finns tillgängliga.
Cell co-kulturer ger kontrollerade miljöer där utredarna kan manipulera interaktioner mellan neuronala och mesenchymal populationer. Samkulturexperiment gör det möjligt att gräva djupare in i signalvägarna som styr tandinnervation och utveckling. Flera av de konventionella metoder som används för att studera celler i samkulturen innebär dock tekniska utmaningar. Till exempel, kristall violett färgning av neurite utväxt kan icke-specifikt fläck Schwann celler som ingår i TG bunt spridningar, och det kan finnas toppar i färgintensitet med relativt små svar7. Mikrofluidiska kammare erbjuder ett attraktivt alternativ, men är betydligt dyrare än transwell filter8,9 och bara tillåta undersökning av neuronala svar på DP sekret. För att ta itu med dessa frågor har vi utvecklat ett protokoll som möjliggör: a) exakt färgning och bildbehandling av TG neurite utväxt som svar på DP sekret, b) genetisk modifiering av DP-celler och / eller TG nervceller för att undersöka specifika signalering vägar, och c) undersökning av DP cell svar på faktorer som utsöndras av TG nervceller. Detta protokoll ger möjlighet att exakt undersöka flera funktioner i tand innervation i den kontrollerade miljön i en in vitro samkultur analys.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den dagliga verksamheten i munhålan kräver att tänderna känner yttre stimuli och inre inflammation för att möjliggöra korrekt användning och underhåll. Endast begränsad information finns dock om de signaler som driver de utvecklingsprocesser av tand innervation. Detta protokoll ger en metod för att isolera och samkultur primära DP celler och TG nervceller för att studera tvärkommunikation mellan de två populationerna. Flera variabler optimerades och lämnar öppna ytterligare forskningsvägar, som beskrivs…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av a) National Institutes of Health / NIAMS (bidragsnummer R01 AR062507 och R01 AR053860 till RS), b) University of Alabama vid Birmingham Dental Academic Research Training (DART) bidrag (nummer T90DE222736 (PI MacDougall)) till SBP från National Institute of Dental and Craniofacial Research / National Institutes of Health, c) En UAB Global Center for Craniofacial, orala och tandsjukdomar (GC-CODED) Pilot och genomförbarhetsbidrag till SBP och d) National Institute of Dental och Craniofacial Forsknings-/nationella hälsoinstitut K99 DE024406 bevilja sbp.
Materials
| 5-Fluoro-2'-deoxyuridine | Sigma-Aldrich | F0503 | Used as a mitotic Inhibitor at 15 μM concentration in co-culture media, Day 2 |
| 24 Well Cell Culture Plate | Corning | 3524 | Co-culture plate |
| Alexa-546 anti-chicken | Invitrogen | A-11040 | Secondary to stain neurite outgrowth labeled by anti-GFP antibody, 1:500 dilution |
| Anti-GFP Antibody | Aves Lab, Inc | GFP-1010 | Primary antibody to label Thy1-YFP neurons, 1:200 dilution |
| Anti-Neurofilament 200 antibody | Sigma-Aldrich | NO142 | Monoclonal primary antibody to label neurons, 1:1000 dilution, alternative if YFP mice are not available |
| B6;129- Tgfbr2tm1Karl/J | The Jackson Laboratory | 12603 | Tgfbr2f/f mouse model used for dental pulp cells in optimized protocol |
| B6.Cg-Tg(Thy1-YFP)16Jrs/J | The Jackson Laboratory | 3709 | Thy1-YFP mouse model genotype used for trigeminal neurons |
| Collagenase Type II | Millipore | 234155-100MG | Used to disperse trigeminal neurons |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10437 | Additive to co-culture media |
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11413-11 | Fine forceps for TG dissection |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | Coats the transwell inserts at final concentration of 10 μg/ml, stock solution is assumed at 1.5 mg/ml |
| Lysis Buffer (Buffer RLT) | Qiagen | 79216 | Extracts RNA from dental pulp cells post co-culture |
| L-Glutamine | Gibco | 25030081 | Additive to co-culture media |
| Micro-dissecting scissors | Sigma-Aldrich | S3146-1EA | Dissection scissors to open skull |
| Microscope Cover Glass | Fisherbrand | 12-545-81 | Circlular coverslip for optional cell culturing and immunofluorescence processing |
| Minimal Essential Medium a | Gibco | 12571063 | Co-culture media base |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15070063 | Antibiotic additive to co-culture media |
| Phosphatase Inhibitor | Sigma-Aldrich | 04 906 837 001 | Additive to RIPA Buffer for extracting protein from dental pulp cells post co-culture |
| Polybrene | Millipore | TR-1003-G | Used to aid in dental pulp cell transfection |
| Poly-D-Lysine | Sigma-Aldrich | P7280 | Coverslip coating to aid dental pulp cellular adhesion |
| Protease Inhibitors | Millipore | 05 892 791 001 | Additive to RIPA Buffer for extracting protein from dental pulp cells post co-culture |
| RNAse/DNAse free eppendorf tubes | Denville | C-2172 | Presterilized 1.7 ml tubes for RNA, DNA or protein collection at the end of assay |
| ThinCert Cell Culture Insert | Greiner Bio-One | 662631 | Transwell inserts for trigeminal neurons in co-culture assays |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200056 | Used fto disperse dental pulp cells |
| Trypsin Type II | Sigma-Aldrich | T-7409 | Used to disperse trigeminal neurons |
| Ultra Fine Forceps | Fine Science Tools | 11370-40 | Ultra fine forceps for dissection |
| Uridine | Sigma-Aldrich | U3750 | Used as a mitotic Inhibitor at 1 μM concentration in co-culture media, Day 2 |
| Vacuum Filtration System | Millipore | SCNY00060 | Steriflip disposable filter, 50 μm nylon net filter |
| Vial forceps | Fine Science Tools | 110006-15 | Long forceps for tissue transfer to conicals |
Referencias
- Moe, K., Sijaona, A., Shrestha, A., Kettunen, P., Taniguchi, M., Luukko, K. Semaphorin 3A controls timing and patterning of the dental pulp innervation. Differentiation. 84 (5), 371-379 (2012).
- Kollar, E. J., Lumsden, A. G. Tooth morphogenesis: the role of the innervation during induction and pattern formation. Journal de biologie buccale. 7 (1), 49-60 (1979).
- Lillesaar, C., Fried, K. Neurites from trigeminal ganglion explants grown in vitro are repelled or attracted by tooth-related tissues depending on developmental stage. Neurociencias. 125 (1), 149-161 (2004).
- Fried, K., Lillesaar, C., Sime, W., Kaukua, N., Patarroyo, M. Target finding of pain nerve fibers: Neural growth mechanisms in the tooth pulp. Physiology & Behavior. 92 (1-2), 40-45 (2007).
- Pagella, P., Jiménez-Rojo, L., Mitsiadis, T. A. Roles of innervation in developing and regenerating orofacial tissues. Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (12), 2241-2251 (2014).
- Luukko, K., Kettunen, P. Integration of tooth morphogenesis and innervation by local tissue interactions, signaling networks, and semaphorin 3A. Cell Adhesion & Migration. , 1-9 (2016).
- Smit, M., Leng, J., Klemke, R. L. Assay for neurite outgrowth quantification. BioTechniques. 35 (2), 254-256 (2003).
- de Almeida, J. F. A., Chen, P., Henry, M. A., Diogenes, A. Stem cells of the apical papilla regulate trigeminal neurite outgrowth and targeting through a BDNF-dependent mechanism. Tissue engineering. Part A. 20 (23-24), 3089-3100 (2014).
- Pagella, P., Miran, S., Mitsiadis, T. Analysis of Developing Tooth Germ Innervation Using Microfluidic Co-culture Devices. Journal of Visualized Experiments. (102), e53114 (2015).
- Coelen, R. J., Jose, D. G., May, J. T. The effect of hexadimethrine bromide (polybrene) on the infection of the primate retroviruses SSV 1/SSAV 1 and BaEV. Archives of Virology. 75 (4), 307-311 (1983).
- Caroni, P. Overexpression of growth-associated proteins in the neurons of adult transgenic mice. Journal of neuroscience methods. 71 (1), 3-9 (1997).
- Alić, I., et al. Neural stem cells from mouse strain Thy1 YFP-16 are a valuable tool to monitor and evaluate neuronal differentiation and morphology. Neuroscience Letters. 634, 32-41 (2016).
- Howroyd, P. C. Dissection of the Trigeminal Ganglion of Nonrodent Species Used in Toxicology Studies. Toxicologic Pathology. , (2019).
- Schwieger, J., Esser, K. H., Lenarz, T., Scheper, V. Establishment of a long-term spiral ganglion neuron culture with reduced glial cell number: Effects of AraC on cell composition and neurons. Journal of Neuroscience Methods. 268, 106-116 (2016).
- Liu, R., Lin, G., Xu, H. An Efficient Method for Dorsal Root Ganglia Neurons Purification with a One-Time Anti-Mitotic Reagent Treatment. PLoS ONE. 8 (4), 60558 (2013).
- Burry, R. W. Antimitotic drugs that enhance neuronal survival in olfactory bulb cell cultures. Brain Research. 261 (2), 261-275 (1983).
- Katzenell, S., Cabrera, J. R., North, B. J., Leib, D. A. Isolation, Purification, and Culture of Primary Murine Sensory Neurons. Methods in molecular biology. 1656, 229-251 (2017).
- Dussor, G. O., Price, T. J., Flores, C. M. Activating transcription factor 3 mRNA is upregulated in primary cultures of trigeminal ganglion neurons. Molecular Brain Research. 118 (1-2), 156-159 (2003).
- Lillesaar, C., Arenas, E., Hildebrand, C., Fried, K. Responses of rat trigeminal neurones to dental pulp cells or fibroblasts overexpressing neurotrophic factors in vitro. Neurociencias. 119 (2), 443-451 (2003).
- Lillesaar, C., Eriksson, C., Fried, K. Rat tooth pulp cells elicit neurite growth from trigeminal neurones and express mRNAs for neurotrophic factors in vitro. Neuroscience Letters. 308 (3), (2001).
- Lillesaar, C., Eriksson, C., Johansson, C. S., Fried, K., Hildebrand, C. Tooth pulp tissue promotes neurite outgrowth from rat trigeminal ganglia in vitro. Journal of neurocytology. 28 (8), 663-670 (1999).
- Chmilewsky, F., Ayaz, W., Appiah, J., About, I., Chung, S. H. Nerve Growth Factor Secretion From Pulp Fibroblasts is Modulated by Complement C5a Receptor and Implied in Neurite Outgrowth. Scientific reports. 6, 31799 (2016).
- Pagella, P., Neto, E., Jiménez-Rojo, L., Lamghari, M., Mitsiadis, T. A. Microfluidics co-culture systems for studying tooth innervation. Frontiers in Physiology. 5, 326 (2014).
- Miura, T., Yokokawa, R. Tissue culture on a chip: Developmental biology applications of self-organized capillary networks in microfluidic devices. Development, Growth & Differentiation. 58 (6), 505-515 (2016).
