Génération d’organoïdes mammaires mosaïques par trypsinisation différentielle

La glande mammaire (MG) est une structure épithéliale tubulaire ressemblant à un arbre encastrée dans un stroma riche en adipocytes. L’épithélium canalaire bilayered comprend une couche externe basale de cellules contractiles et myoépithelial (MyoECs) et une couche interne de cellules épithéliales luminales et sécrétrices (LEC), encerclant un lumen central¹. Pendant la lactation lorsque les MyoEC externes se contractent pour presser le lait des LEC alvéolaires intérieurs, le MG subit de nombreux changements qui sont sous le contrôle de facteurs de croissance (p. ex., EGF et FGF) et d’hormones (p. ex. progestérone, insuline et prolactine). Ces changements provoquent la différenciation des structures spécialisées, les alvéoles, qui synthétisent et sécrètent du lait pendant la lactation¹. L’épithélia mammaire peut être manipulée expérimentalement à l’aide de techniques dans lesquelles soit des fragments épithéliaux de tissu, des cellules, ou même une seule cellule basale sont transplantés dans des coussinets de graisse mammaire hôte, précoléarisés du parenchyme mammaire endogène, et a permis de se développer pour reconstituer un arbre épithélial complet^{entier,3,,4,5}. La transplantation est une technique puissante, mais elle prend beaucoup de temps et impossible si une mutation entraîne une létalité embryonnaire précoce (avant E14) qui empêche le sauvetage de l’anlage mammaire transplantable. En outre, les chercheurs souhaitent fréquemment faire des recherches sur les rôles des deux compartiments différents, qui sont dérivés de cellules progénitrices restreintes à la lignée. Bien que la technologie Cre-lox permette une manipulation génétique différentielle des MyoEC et des LEC, il s’agit également d’une entreprise longue et coûteuse. Ainsi, depuis les années 1950, les chercheurs ont utilisé des organoïdes mammaires in vitro comme un moyen relativement facile et efficace de répondre aux questions concernant la structure et la fonction des tissus mammaires^6,,7.

Dans les premiers protocoles décrivant l’isolement et la culture des cellules épithéliales mammaires primaires, les chercheurs ont constaté qu’une matrice de membrane de sous-sol (BME), composée d’un caillot de plasma et d’extrait d’embryon de poulet, était nécessaire pour des fragments de MG cultivés sur un plat⁶. Dans les décennies suivantes, des matrices extracellulaires (ECMs, collagène, et la matrice de protéines gelées sécrétées par les cellules de sarcome murine Engelbreth-Holm-Swarm) ont été développées pour faciliter la culture 3D et mieux imiter l’environnement in vivo^7,8,9,10. Cellules de culturing dans des matrices 3D indiquées par de multiples critères (morphologie, expression génique, et réactivité hormonale) qu’un tel microenvironnement de meilleurs modèles dans les processus physiologiques^{vivo 9,10,11,12}. La recherche utilisant les cellules murines primaires a identifié des facteurs de croissance et des morphogènes clés nécessaires pour l’entretien prolongé et la différenciation des organoïdes¹³. Ces études ont préparé le terrain pour le protocole présenté ici, et pour la culture des cellules mammaires humaines comme organoïdes 3D, qui est maintenant un outil clinique moderne, permettant la découverte de médicaments et le dépistage des médicaments sur les échantillons de patients¹⁴. Dans l’ensemble, le culturing organoïde met en évidence les capacités d’auto-organisation des cellules primaires et leurs contributions à la morphogenèse et à la différenciation.

Présenté ici est un protocole à la culture épithélia murine qui peut être différencié en acini producteur de lait. Une technique de trypsinisation différentielle est utilisée pour isoler les MyoEC et les LEC qui composent les deux compartiments cellulaires MG distincts. Ces fractions de cellules séparées peuvent alors être manipulées génétiquement pour surexprimer ou renverser la fonction du gène. Parce que la lignée intrinsèque, l’auto-organisation est une propriété innée de cellules épithéliales mammaires^15,16,17, recombiner ces fractions cellulaires permet aux chercheurs de générer bilayered, organoïdes mosaïques. Nous commençons par digérer enzymatiquement le tissu adipeux, puis incuber les fragments mammaires sur un plat de culture tissulaire pour 24 h (figure 1). Les fragments de tissu s’installent sur les plats en polystyrène comme fragments bilayered avec leur organisation in vivo : couche myoepithelial externe entourant les couches lumineuses intérieures. Cette organisation cellulaire permet l’isolement des MyoECs externes par trypsin-EDTA (0,05 %) traitement pour 3-6 min suivi d’un deuxième tour de trypsin-EDTA (0,05%) traitement qui détache les LEC intérieurs restants(figure 2). Ainsi, ces types de cellules avec une sensibilité différente à la trypsine sont isolés et peuvent ensuite être mélangés et plaqués dans ECM(figure 3). Les cellules subissent l’auto-organisation pour former des sphères bilayered, comprenant une couche externe de MyoECs entourant les LEC intérieurs. La formation de Lumen se produit pendant que les cellules se développent dans un milieu contenant un cocktail de facteurs de croissance (voir recettes pour le milieu de croissance)¹³. Après 5 jours, les organoïdes peuvent être différenciés en acini producteurs de lait en passant à Alveologenesis Medium (voir recettes et figure 3F) et incubés pendant encore 5 jours. Alternativement, les organoïdes continueront à se développer et se brancheront dans Growth Medium pendant au moins 10 jours. Les organoïdes peuvent être analysés à l’aide d’immunofluorescence(figure 3D-F)ou libérés de l’ECM à l’aide d’une solution de récupération (voir tableau des matériaux)et analysés par d’autres méthodes (p. ex., immunoblot, RT-qPCR).