Quantificação da lixiviação metálica na cromatografia imobilizada da afinidade metálica

Desde a sua criação por Porath e colegas de trabalho¹, a cromatografia de afinidade metálica imobilizada (IMAC) tornou-se um método de escolha para separar rapidamente as proteínas com base em sua capacidade de se relacionar com íons de metal de transição, como Zn²⁺, Ni²⁺,²⁺, e Co²⁺. Isso é mais comumente feito através de etiquetas de poli-histidina projetadas e agora é uma das técnicas de purificação cromatográfica mais comuns para o isolamento de proteínas recombinantes^2. O IMAC também encontrou aplicações além da purificação de proteínarecombinante como uma forma de isolar quinolonas, tetraciclinas, aminoglicosídeos, macrolídeos e β-lacmas para análise de amostras alimentares³ e como um passo na identificação de marcadores de proteína sangue-soro para cânceres de fígado e pâncreas^4,5. Não surpreendentemente, IMAC também se tornou um método de escolha para o isolamento de uma série de enzimas bioenergéticas nativas^6,7,8,9,10. No entanto, a implementação bem-sucedida desses métodos de purificação para estudos sobre proteínas bioenergéticas enzimáticas ativas depende da presença de níveis insignificantes de caations metálicas lixiviadas da matriz da coluna para o eluate. As caations metálicas divalentes comumente usadas no IMAC têm significado biológico patológico conhecido, mesmo em baixas concentrações^11,12. O efeito fisiológico desses metais é mais pronunciado em sistemas bioenergéticos, onde podem ser letais como inibidores da respiração celular ou fotossíntese^13,14,15. Questões semelhantes são inevitáveis para a maioria das classes de proteínas onde metais contaminantes residuais podem interferir com as funções biológicas de uma proteína ou caracterização com técnicas bioquímicas e biofísicas.

Enquanto os níveis de contaminação de metal condições oxidantes e o uso de imidazol como eluante são tipicamente baixos^16,os isolamentos proteicos realizados na presença de agentes redutores de cisteína (DTT, β-mercaptoethanol, etc.) ou com quelantes mais fortes como histidina^17,18 ou ácido etilediátetraa (EDTA) resultam em níveis muito mais altos de contaminação de metal^19,20. Da mesma forma, uma vez que os íons metálicos nas resinas iMAC são frequentemente coordenados por grupos carboxílicos, as eluções de proteínas realizadas em condições ácidas também são susceptíveis de ter níveis muito mais elevados de contaminação de metais. O conteúdo metálico em soluções pode ser avaliado usando espectroscopia de absorção atômica (AAS) e espectrometria de massa plasmática (ICP-MS) indutivamente acoplada até um limite de detecção na faixa ppb-ppt^21,22,23,24. Infelizmente, a AAS e o ICP-MS não são meios realistas para detecção em um laboratório de bioquímica tradicional, pois esses métodos exigiriam acesso a equipamentos e treinamento especializados.

Trabalhos anteriores de Brittain^25,26 investigaram o uso de hidroxinaphthol azul (HNB) como forma de identificar a presença de metais de transição em solução. No entanto, houve várias contradições internas nos dados²⁰ e essas obras não ofereceram um protocolo adequado. Estudos de Temel et al.²⁷ e Ferreira et al.²⁸ expandiram o trabalho de Brittain com a HNB como um potencial indicador de metal. No entanto, Temel desenvolveu um protocolo que faz uso de AAS para análise de amostras, usando HNB apenas como agente quelante. O estudo de Ferreira utilizou a mudança nos espectros de absorção de HNB a 563 nm, região dos espectros HNB de corlivre que se sobrepõe fortemente aos espectros de complexos de metais HNB no pH 5.7, tornando a sensibilidade ao ensaio bastante baixa, bem como resultando em afinidade de ligação metálica relativamente fraca²⁰. Para abordar problemas em nosso próprio laboratório com a lixiviação Ni²⁺ da IMAC, expandimos o trabalho feito pela Brittain^25,26 e Ferreria²⁸ para desenvolver um ensaio fácil capaz de detectar níveis de nanomolar de vários metais de transição. Mostramos que a HNB liga níquel e outros comuns para metais IMAC com afinidades de ligação subnamolar e formam 1:1 complexo em uma ampla gama de valores de pH²⁰. O ensaio aqui relatado é baseado nestes resultados e utiliza mudanças do absorveance no espectro de HNB em 647 nm para o quantification do metal. O ensaio pode ser realizado na faixa de pH fisiológico usando amortecedores comuns e instrumentação encontrada em um laboratório típico de bioquímica usando detecção colorimétrica e quantificação de complexos de corante metálico e a mudança associada na absorção do corante livre quando se liga ao metal.