Kwantificering van metaal uitspoeling in geïmmobiliseerde metaal Affiniteits chromatografie

Sinds de oprichting door Porath en co-workers¹, geïmmobiliseerde metaal affiniteit chromatografie (iMac) is uitgegroeid tot een methode van keuze om snel te scheiden van eiwitten op basis van hun vermogen om te binden met overgangsmetalen ionen zoals Zn^{2 +}, ni^{2 +}, Cu^{2 +}, en co^{2 +}. Dit wordt meestal gedaan via engineered poly-histidine Tags en is nu een van de meest voorkomende chromatografische zuivering technieken voor de isolatie van recombinant eiwitten². IMac heeft ook toepassingen gevonden die verder gaan dan recombinant-eiwit zuivering als een manier om quinolonen, tetracyclines, aminoglycosiden, macroliden en β-lactams voor voedsel monsteranalyse³ te isoleren en als een stap in het identificeren van bloed-serumeiwit markers voor lever-en pancreaskanker^4,5. Niet verrassend, iMac is ook uitgegroeid tot een methode van keuze voor de isolatie van een aantal inheemse Bioenergetics enzymen^6,7,8,9,10. De succesvolle toepassing van deze zuiverings methoden voor studies op enzymatisch actieve bioenergetische eiwitten is echter afhankelijk van de aanwezigheid van verwaarloosbare metaal kationen uit de kolom matrix in het eluaat. De divalente metaal kationen die gewoonlijk in iMac worden gebruikt, hebben een pathologisch biologisch belang, zelfs bij lage concentraties^11,12. Het fysiologische effect van deze metalen is het meest uitgesproken in bioenergetische systemen, waar ze dodelijk kunnen blijken als remmers van cellulaire ademhaling of fotosynthese^13,14,15. Vergelijkbare problemen zijn onvermijdelijk voor de meerderheid van de eiwit klassen waar rest verontreiniging metalen kunnen interfereren met de biologische functies van een eiwit of karakterisering met biochemische en biofysische technieken.

Terwijl het gehalte aan metaalverontreiniging onder oxiderende omstandigheden en het gebruik van imidazol als eluant doorgaans laag is¹⁶, eiwit isolaties uitgevoerd in de aanwezigheid van cysteïne reducerende agentia (DTT, β-mercaptoethanol, enz.) of met sterkere chelatoren zoals histidine^17,18 of ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) resulteren in veel hogere niveaus van metaalverontreiniging^19,20. Evenzo, aangezien metaalionen in IMAC-harsen vaak worden gecoördineerd door Carbon groepen, hebben eiwit eluties die onder zure omstandigheden worden uitgevoerd waarschijnlijk ook veel hogere niveaus van metaalverontreiniging. Metaalgehalte in oplossingen kan worden beoordeeld met behulp van atomische Absorptie spectroscopie (aas) en inductief gekoppeld plasma-massaspectrometrie (ICP-MS) tot een aantoonbaarheidsgrens in het ppb-ppt-bereik^21,22,23,24. Helaas, AAS en ICP-MS zijn niet realistisch middelen voor detectie in een traditionele biochemie Lab omdat deze methoden toegang tot gespecialiseerde apparatuur en training zou vereisen.

Vorig werk van Brittain^25,26 onderzocht het gebruik van hydroxynaphthol Blue (hnb) als een manier om de aanwezigheid van overgangsmetalen in oplossing te identificeren. Er waren echter verschillende interne contradicties in de data²⁰ en die werken hebben geen adequaat protocol kunnen bieden. Studies van Temel et al.²⁷ en Ferreira et al.²⁸ verbreiden het werk van Brittain met hnb als een potentiële metalen indicator. Echter, Temel ontwikkelde een protocol dat gebruik maakt van AAS voor monsteranalyse, met behulp van HNB alleen als een chelerende agent. De studie van Ferreira gebruikte de verandering in het HNB extinctie Spectra bij 563 nm, een gebied van de Free-Dye HNB spectra die zwaar overlapt met de spectra van HNB-Metal complexen bij pH 5,7, waardoor de gevoeligheid van de assay vrij laag is en ook resulteert in relatief zwakke metaalbinding affiniteit²⁰. Om problemen in ons eigen lab met ni^{2 +} uitspoeling van iMac aan te pakken, hebben we het werk van Brittain^25,26 en Ferreria²⁸ uitgebreid om een eenvoudige assay te ontwikkelen die in staat is om nanomolaire niveaus van verschillende overgangsmetalen te detecteren. We toonden aan dat HNB nikkel bindt en andere vaak voor IMAC-metalen met sub-nanomolaire bindende affiniteiten en Form 1:1 complex over een breed scala aan pH-waarden²⁰. De hier gerapporteerde assay is gebaseerd op deze bevindingen en maakt gebruik van absorptie veranderingen in het HNB-spectrum bij 647 nm voor metaal kwantificering. De test kan worden uitgevoerd in de fysiologische pH-reeks met behulp van gemeenschappelijke buffers en instrumentatie gevonden in een typische biochemie Lab met behulp van colorimetrische detectie en kwantificering van metaal-Dye complexen en de bijbehorende verandering in de extinctie van de vrije-kleurstof wanneer het bindt aan metaal.