Summary

ゼブラフィッシュ胚と幼虫の全山免疫賦形化学

Published: January 29, 2020
doi:

Summary

ここでは、ゼブラフィッシュ胚および幼虫の全製剤におけるタンパク質の蛍光抗体媒介検出に関するプロトコルを提示する。

Abstract

免疫賦技化学は、正常な発達状態と疾患状態の両方でタンパク質の発現および局在を調べる広く使用されている技術です。多くの免疫組織化学プロトコルは哺乳類の組織および組織切片に最適化されているが、これらのプロトコルは、多くの場合、非哺乳類モデル生物の修飾および最適化を必要とする。ゼブラフィッシュは、発達過程の分子、遺伝、細胞の生物学的メカニズムを調べるための基礎的、生物医学的、および翻訳的研究のモデルシステムとしてますます使用されています。ゼブラフィッシュはモデルシステムとして多くの利点を提供しますが、最適なタンパク質検出のために修正技術も必要です。ここでは、ゼブラフィッシュ胚と幼虫の全実装蛍光免疫化学に関するプロトコルを提供します。このプロトコルでは、さらに、使用できるいくつかの異なる取り付け戦略と、各戦略が提供する利点と欠点の概要について説明します。また、このプロトコルの改変により、全実装組織における発がん基質の検出と、切片された幼虫組織における蛍光検出を可能にする。このプロトコルは、多くの発達段階および胚構造の研究に広く適用可能である。

Introduction

ゼブラフィッシュ(Danio rerio)は、短期間、急速な発達、遺伝的手法の評価可能性など、いくつかの理由から、生物学的プロセスの研究のための強力なモデルとして登場しました。その結果、ゼブラフィッシュは、一般的に、毒性研究や創薬のためにハイスループットの低分子スクリーンで使用されています。ゼブラフィッシュはまた、単一の女性が日常的に一度に50〜300個の卵を生産することができ、光学的に透明な胚が外部的に発達し、発生過程を効率的に視覚化できることを考えると、発達プロセスの研究のための魅力的なモデルである。しかし、初期の研究は、逆遺伝的技術を確立する際の課題のために、N-エチルN-ニトロソーレ(ENU)または他の変異原体を使用して前方遺伝的スクリーンに主に依存していた。およそ20年前、ゼブラフィッシュで最初にモルフォリノが使用され、標的遺伝子1をノックダウンしました。モルフォリノスは、初期の発生段階で胚への微小注入後の標的mRNAの翻訳を阻害する小さなアンチセンスオリゴヌクレオチドである。モルフォリノの主な弱点は、細胞が分裂するにつれて希釈され、一般的に受精後72時間(hpf)によって有効性を失うことである。形態素はゼブラフィッシュ遺伝子破壊のための強力なツールであり続けるが、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、およびクラスター化された定期的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート(CRISPR)は、ゼブラフィッシュゲノム2、3を直接標的にするために使用されている。これらの逆遺伝戦略は、前方遺伝学および高スループットスクリーンと組み合わせて、遺伝子発現および機能を研究するための強力なモデルとしてゼブラフィッシュを確立している。

遺伝子機能を研究する能力は、一般に、遺伝子または遺伝子産物発現の時空間的分布の評価を必要とする。初期の開発中にこのような発現パターンを視覚化するために最も一般的に使用される2つの技術は、その後のハイブリダイゼーション(ISH)と全実装免疫賦技化学(IHC)です。in in situハイブリダイゼーションは1969年に初めて開発され、生物4におけるmRNA発現を検出するために標識アンチセンスRNAプローブの使用に依存している。対照的に、標識抗体は、タンパク質発現を視覚化するために免疫組織化学に使用されます。検出用にタンパク質を標識するという考えは1930年代5年にさかのぼり、FITC標識抗体が感染組織6の病原細菌を検出するために使用された1941年に最初のIHC実験が発表されました。ISH と IHC は、その後の数十年にわたって大幅に進化し、改善し、現在では分子診断研究所7891011で日常的に使用されています。どちらの手法にも利点と欠点がありますが、IHC には ISH に対していくつかの利点があります。実際には、IHCはISHよりも時間がかかり、一般抗体のコストに応じて一般的に安価です。また、mRNA発現は、mRNAの豊富なmRNA量12によって約3分の1のタンパク質の存在量変動しか説明できないことがマウスおよびヒトで実証されているように、常に確実なタンパク質発現指標とは限らない。このため、IHC は可能な場合に ISH データを確認する重要な補足です。最後に、IHCは、イシュ13、14、15で決定できない細胞内および共局在データを提供することができる。ここでは、ゼブラフィッシュ胚と幼虫の全山中の免疫賦形化学によってタンパク質を確実に検出する段階的な方法を説明します。この技術の目的は、胚全体に目的のタンパク質の空間的および時間的発現を決定することです。この技術は、抗原特異的一次抗体と蛍光タグ付き二次抗体を利用する。このプロトコルは、スライド取り付けされた組織切片での使用や、蛍光の代わりに発泡性基質での使用に容易に適応可能です。このプロトコルを用いて、ゼブラフィッシュ骨格筋の開発は、アセチルコリン受容体に加えて、電夫グルタミン酸受容体を発現することを実証する。NMDA型グルタミン酸受容体サブユニットは、23hpfで縦筋上で検出可能である。

Protocol

このプロトコルに記載されているゼブラフィッシュ繁殖成人および胚を扱うための手順は、マレー州立大学の機関動物ケアおよび使用委員会によって承認された。 1. 胚の採取と固定 一晩システム水で満たされたメッシュまたはスロットライナーでタンクに大人のゼブラフィッシュ混合セックスペアまたはグループを配置することにより、産卵タンクを準備します…

Representative Results

全実装免疫組織化学は、無傷の動物におけるタンパク質発現の空間パターンを検出するために抗体を使用する。免疫組織化学の基本的なワークフロー(図1に示す)は、ゼブラフィッシュの繁殖、胚の発生および調製、非特異的抗原のブロッキング、目的のタンパク質を標的とする抗原特異的一次抗体の使用、標識された二次抗体を有する一次抗体?…

Discussion

免疫組織化学は、生物に関心のあるほぼすべてのタンパク質の時空間的発現を特徴付けるために使用できる汎用性の高いツールです。免疫組織化学は、多種多様な組織およびモデル生物に使用される。このプロトコルはゼブラフィッシュでの使用のために最適化されています。異なる種の免疫組織化学は、異なる固定および取り扱い技術、種および内因性ペルオキシダーゼの存在に応じて溶?…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

NIH助成金8P20GM103436 14からの資金。

Materials

Agarose Fisher Scientific BP160-100
Aluminum foil, heavy duty Kirkland Any brand may be substituted
Anti-NMDA antibody Millipore Sigma MAB363
Anti-phospho-Histone H3 (Ser10), clone RR002 Millipore Sigma 05-598
Anti-pan-AMPA receptor (GluR1-4) Millipore Sigma MABN832
Bovine serum albumin (BSA) Fisher Scientific BP1600-100
Calcium Nitrate [Ca(NO3)2] Sigma Aldrich C4955
Centrifuge tubes, 1.5 mL Axygen MCT150C
Clear nail polish Sally Hanson Any nail polish or hardener may be subsituted
Depression (concavity) slide Electron Miscroscopy Sciences 71878-01
Diaminobenzidine Thermo Scientific 1855920
Embryo medium, Danieau, 30% 17.4 mM NaCl, 0.21 mM KCl, 0.12 mM MgS04, 0.18 mM Ca(NO3)2, 1.5 mM HEPES in ultrapure water.
Embryo medium, E2 7.5 mM NaCl, 0.25 mM KCl, 0.5 mM MgSO4, 75 uM KH2PO4, 25 uM Na2HPO4, 0.5 mM CaCl2, 0.35 mM NaHCO3, 0.5 mg/L methylene blue
Floating tube holder Thermo Scientific 59744015
Fluorescence compound microscope Leica Biosystems DMi8
Fluorescence stereomicroscope Leica Biosystems M165-FC
Glass coverslips 18 x 18 Corning 284518
Glass coverslips 22 x 60 Thermo Scientific 22-050-222
Glass slides Fisher Scientific 12-544-4
Glycerol Fisher Scientific BP229-1
Goat anti-mouse IgG Alexa 488 Invitrogen A11001
HEPES solution Sigma Aldrich H0887
Humid chamber with lid Simport M920-2
Hydrogen peroxide, 30% Fisher Scientific H325-500
Immunedge pap pen Vector labs H-4000
Insect pins, size 00 Stoelting 5213323
Magnesium Sulfate (MgSO4 · 7H2O) Sigma Aldrich 63138
Mesh strainer Oneida Any brand may be substituted
Methanol Sigma Aldrich 34860
Methylene blue Sigma Aldrich M9140
Micro-tube cap lock Research Products International 145062
Microwave oven Toastmaster
Mouse IgG Sigma Aldrich I8765
Normal goat serum Millipore Sigma S02L1ML
Nutating mixer Fisher Scientific 88-861-044
Paraformaldehyde Fisher Scientific 04042-500
Pasteur pipettes Fisher Scientific 13-678-20C
PBTriton 1% TritonX-100 in 1x PBS
Permount mounting medium Fisher Chemical SP15-500
Petri dish (glass) Pyrex 3160100
Petri dish (plastic) Fisher Scientific FB0875713
1-phenyl 2-thiourea Acros Organics 207250250
Phosphate buffered saline (PBS), 10x, pH 7.4 Gibco 70011-044
Phosphate buffered saline (PBS), 1x 1x made from 10x stock diluted in dH2O
Potassium Chloride (KCl) Sigma Aldrich P9333
Potassium Hydroxide (KOH) Fisher P250-500
Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) Sigma Aldrich P5655
Pronase Sigma Aldrich 10165921001
Proteinase K Invitrogen AM2544
Sodium Chloride (NaCl) Sigma Aldrich S7653
Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4) Sigma Aldrich S7907
Spawning tank with lid and insert Aquaneering ZHCT100
SuperBlock PBS Thermo Scientific 37515
Superfrost + slides Fisher Scientific 12-550-15
Superglue gel 3M Scotch
TNT 100 mM Tris, pH 8.0; 150 mM NaCl; 0.1% Tween20; made in dH2O
Transfer pipette Fisher 13-711-7M
Trichloracetic Acid (Cl3CCOOH) Sigma Aldrich T6399
Tris Base Fisher Scientific S374-500
TritonX-100 Sigma Aldrich T9284
Tween20 Fisher Scientific BP337-500
Ultrafine forceps Fisher Scientific 16-100-121
Water, ultrapure/double distilled Fisher Scientific W2-20

Referencias

  1. Nasevicius, A., Ekker, S. C. Effective targeted gene ‘knockdown’ in zebrafish. Nature Genetics. 26 (2), 216-220 (2000).
  2. Gaj, T., Gersbach, C. A., Barbas, C. F. ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends in Biotechnology. 31 (7), 397-405 (2013).
  3. Irion, U., Krauss, J., Nusslein-Volhard, C. Precise and efficient genome editing in zebrafish using the CRISPR/Cas9 system. Development. 141 (24), 4827-4830 (2014).
  4. van der Ploeg, M. Cytochemical nucleic acid research during the twentieth century. European Journal of Histochemistry. 44 (1), 7-42 (2000).
  5. Marrack, J. Nature of Antibodies. Nature. 133 (3356), 292-293 (1934).
  6. Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N. Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 47 (2), 200-202 (1941).
  7. Lopez, M. E. Combined in situ Hybridization/Immunohistochemistry (ISH/IH) on Free-floating Vibratome Tissue Sections. Bio-protocol. 4 (18), (2014).
  8. Morimoto, M., Morita, N., Ozawa, H., Yokoyama, K., Kawata, M. Distribution of glucocorticoid receptor immunoreactivity and mRNA in the rat brain: an immunohistochemical and in situ hybridization study. Neuroscience Research. 26 (3), 235-269 (1996).
  9. Newton, S. S., Dow, A., Terwilliger, R., Duman, R. A simplified method for combined immunohistochemistry and in-situ hybridization in fresh-frozen, cryocut mouse brain sections. Brain Research Protocols. 9 (3), 214-219 (2002).
  10. Corthell, J. T., Corthell, J. T. . Basic Molecular Protocols in Neuroscience: Tips, Tricks, and Pitfalls. , 105-111 (2014).
  11. Corthell, J. T., Corthell, J. T. . Basic Molecular Protocols in Neuroscience: Tips, Tricks, and Pitfalls. , 91-103 (2014).
  12. Vogel, C., Marcotte, E. M. Insights into the regulation of protein abundance from proteomic and transcriptomic analyses. Nature Reviews Genetics. 13 (4), 227-232 (2012).
  13. Semache, M., Ghislain, J., Zarrouki, B., Tremblay, C., Poitout, V. Pancreatic and duodenal homeobox-1 nuclear localization is regulated by glucose in dispersed rat islets but not in insulin-secreting cell lines. Islets. 6 (4), e982376 (2014).
  14. Kang, H. S., Beak, J. Y., Kim, Y. S., Herbert, R., Jetten, A. M. Glis3 is associated with primary cilia and Wwtr1/TAZ and implicated in polycystic kidney disease. Molecular and Cellular Biology. 29 (10), 2556-2569 (2009).
  15. Billova, S., Galanopoulou, A. S., Seidah, N. G., Qiu, X., Kumar, U. Immunohistochemical expression and colocalization of somatostatin, carboxypeptidase-E and prohormone convertases 1 and 2 in rat brain. Neurociencias. 147 (2), 403-418 (2007).
  16. Westerfield, M. . The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio Rerio). , (2000).
  17. Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. . Zebrafish: A Practical Approach. , (2002).
  18. Cheng, C. N., Li, Y., Marra, A. N., Verdun, V., Wingert, R. A. Flat mount preparation for observation and analysis of zebrafish embryo specimens stained by whole mount in situ hybridization. Journal of Visualized Experiments. (89), (2014).
  19. Brennan, C., Mangoli, M., Dyer, C. E. F., Ashworth, R. Acetylcholine and calcium signalling regulates muscle fibre formation in the zebrafish embryo. Journal of Cell Science. 118 (22), 5181 (2005).
  20. Liu, D. W., Westerfield, M. Clustering of muscle acetylcholine receptors requires motoneurons in live embryos, but not in cell culture. The Journal of Neuroscience. 12 (5), 1859 (1992).
  21. Borodinsky, L. N., Spitzer, N. C. Activity-dependent neurotransmitter-receptor matching at the neuromuscular junction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (1), 335-340 (2007).
  22. Brunelli, G., et al. Glutamatergic reinnervation through peripheral nerve graft dictates assembly of glutamatergic synapses at rat skeletal muscle. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (24), 8752-8757 (2005).
  23. Hans, F., Dimitrov, S. Histone H3 phosphorylation and cell division. Oncogene. 20 (24), 3021-3027 (2001).
  24. Yee, N. S., Pack, M. Zebrafish as a model for pancreatic cancer research. Methods in Molecular Medicine. 103, 273-298 (2005).
  25. Seth, A., Stemple, D. L., Barroso, I. The emerging use of zebrafish to model metabolic disease. Disease Models & Mechanisms. 6 (5), 1080-1088 (2013).
  26. Fontana, B. D., Mezzomo, N. J., Kalueff, A. V., Rosemberg, D. B. The developing utility of zebrafish models of neurological and neuropsychiatric disorders: A critical review. Experimental Neurology. 299 (Pt A), 157-171 (2018).
  27. Richter, K. N., et al. Glyoxal as an alternative fixative to formaldehyde in immunostaining and super-resolution microscopy. The EMBO journal. 37 (1), 139-159 (2018).
  28. Elsalini, O. A., Rohr, K. B. Phenylthiourea disrupts thyroid function in developing zebrafish. Development genes and evolution. 212 (12), 593-598 (2003).
  29. Wang, W. D., Wang, Y., Wen, H. J., Buhler, D. R., Hu, C. H. Phenylthiourea as a weak activator of aryl hydrocarbon receptor inhibiting 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin-induced CYP1A1 transcription in zebrafish embryo. Biochemical pharmacology. 68 (1), 63-71 (2004).
  30. Bohnsack, B. L., Gallina, D., Kahana, A. Phenothiourea sensitizes zebrafish cranial neural crest and extraocular muscle development to changes in retinoic acid and IGF signaling. PloS one. 6 (8), e22991 (2011).
  31. Inoue, D., Wittbrodt, J. One for all–a highly efficient and versatile method for fluorescent immunostaining in fish embryos. PLoS One. 6 (5), e19713 (2011).

Play Video

Citar este artículo
Hammond-Weinberger, D. R., ZeRuth, G. T. Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae. J. Vis. Exp. (155), e60575, doi:10.3791/60575 (2020).

View Video