Intero Monte Immunohistochimica in Embrioni e Larve di pesce zebra

Il pesce zebra (Danio rerio) è emerso come un potente modello per lo studio dei processi biologici per diversi motivi, tra cui tempi di breve generazione, rapido sviluppo e amenabilità alle tecniche genetiche. Di conseguenza, i pesci zebra sono comunemente utilizzati in schermi ad alta produttività di piccole molecole per la ricerca tossicologica e la scoperta di farmaci. Il pesce zebra è anche un modello interessante per lo studio dei processi di sviluppo, dato che una singola femmina può produrre regolarmente 50-300 uova alla volta e gli embrioni otticamente chiari si sviluppano esternamente consentendo una visualizzazione efficiente dei processi di sviluppo. Tuttavia, le prime ricerche si basavano principalmente su schermi genetici in avanti utilizzando N-ethyl-N-nitrosourea (ENU) o altri mutageni a causa di sfide nello stabilire tecniche genetiche inverse. Circa due decenni fa, i morfolino sono stati utilizzati per la prima volta nei pesci zebra per abbattere i geni mirati¹. I morfolino sono piccoli oligonucleotidi antisensi che inibiscono la traduzione dell’mRNA bersaglio dopo la microiniezione in un embrione in una fase di sviluppo precoce. Una delle principali debolezze dei morfemole è che vengono diluite poiché le cellule si dividono e generalmente perdono efficacia di 72 ore dopo la fecondazione (hpf). Mentre i morfolino rimangono un potente strumento per la perturbazione del gene dei pesci zebra, le nucleasi effettore (TALEN) di trascrizione attivatori, le nucleasi zinco-dita (FN) e le ripetizioni palindromiche brevi (CRISPR) raggruppate regolarmente interspaziate (CRISPR) vengono utilizzate più recentemente per colpire direttamente il genoma del pesce zebra^2,3. Queste strategie genetiche inverse, in combinazione con la genetica avanzata e gli schermi ad alta velocità, hanno stabilito il pesce zebra come un potente modello per studiare l’espressione e la funzione genica.

La capacità di studiare la funzione genica richiede generalmente una valutazione della distribuzione spatio-temporale dell’espressione genica o del prodotto genico. Le due tecniche più comunemente utilizzate per visualizzare tali modelli di espressione durante lo sviluppo precoce sono l’ibridazione in situ (ISH) e l’immunohistochimica a monte intero (IHC). L’ibridazione in situ è stata sviluppata per la prima volta nel 1969 e si basa sull’uso di sonde di RNA antisenso etichettate per rilevare l’espressione di mRNA in un organismo⁴. Al contrario, gli anticorpi etichettati sono utilizzati nell’immunoistochimica per visualizzare l’espressione proteica. L’idea di etichettare le proteine per il rilevamento risale ai⁵ del 1930 e il primo esperimento IHC è stato pubblicato nel 1941 quando gli anticorpi etichettati FITC sono stati utilizzati per rilevare batteri patogeni nei tessuti infetti⁶. ISH e IHC si sono evoluti e migliorati in modo significativo nel corso dei decenni successivi e sono ora entrambi regolarmente utilizzati nel laboratorio di ricerca molecolare e diagnostica^7,8,9,10,11. Sebbene entrambe le tecniche abbiano vantaggi e svantaggi, IHC offre diversi vantaggi rispetto a ISH. In pratica, IHC è molto meno dispendioso in termini di tempo di ISH ed è generalmente meno costoso a seconda del costo dell’anticorpo primario. Inoltre, l’espressione dell’mRNA non è sempre una metrica affidabile dell’espressione proteica, come è stato dimostrato nei topi e negli esseri umani, che solo circa un terzo della variazione dell’abbondanza proteica può essere spiegata dall’abbondanza di mRNA¹². Per questo motivo, IHC è un importante integratore per confermare i dati ISH, quando possibile. Infine, IHC può fornire dati subcellulari e di co-localizzazione che non possono essere determinati da ISH^13,14,15. Qui, descriviamo un metodo passo-passo per rilevare in modo affidabile le proteine mediante immunostachimica in embrioni e larve di pesci zebra di montaggio intero. L’obiettivo di questa tecnica è determinare l’espressione spaziale e temporale di una proteina di interesse per l’intero embrione. Questa tecnologia utilizza anticorpi primari specifici dell’antigene e anticorpi secondari fluorescenti. Il protocollo è facilmente adattabile all’uso su sezioni di tessuto montate su slittamenti e per l’uso con substrati cromogenici al posto della fluorescenza. Utilizzando questo protocollo, dimostriamo che lo sviluppo del muscolo scheletrico del pesce zebra esprime i recettori del glutammato ionotropico, oltre ai recettori dell’acetilcolina. Le sottounità del recettore del glutammato di tipo NMDA sono rilevabili sul muscolo longitudinale a 23 hpf.