يصف هذا البروتوكول التشريح المجهري للتقاط الليزر لعزل الغضروف والعظم من الأجزاء المجمدة الطازجة من جنين الفاره. الغضروف والعظم يمكن تصورها بسرعة بواسطة تلطيخ البنفسج كريريل وجمعت علي وجه التحديد لإنتاج الحمض الريبي النيبالي عاليه الجودة للتحليل الناسخ.
التشريح المجهري للتقاط الليزر (LCM) هو أداه قويه لعزل أنواع الخلايا المحددة أو المناطق ذات الاهتمام من الانسجه غير المتجانسة. التعقيد الخلوي والجزيئي للعناصر الهيكل العظمي يزيد مع التنمية. تغاير الانسجه ، مثل في واجهه العناصر الغضروفية والعظمية مع بعضها البعض أو مع الانسجه المحيطة بها ، هو عقبه واحده لدراسة تطوير الغضروف والعظام. بروتوكولنا يوفر طريقه سريعة لمعالجه الانسجه وعزل الغضروف والعظام التي تعطي الحمض الريبي النيبالي عاليه الجودة لتحليل التعبير الجيني. يتم تقسيم الانسجه المجمدة الطازجة من الاجنه الماوس ويتم استخدام قصيرة البنفسجية التلون الأرجواني لتصور الغضروف والعظم مع ألوان المتميزة من الانسجه المحيطة بها. ثم يتم تجفيف الشرائح بسرعة ، ويتم عزل الغضروف والعظم في وقت لاحق من قبل LCM. التقليل من التعرض للحلول المائية اثناء هذه العملية يحافظ علي سلامه الحمض الريبي النيبالي. تم جمع بنجاح الغضروف الماوس Meckel وعظم فك في E 16.5 وتحليل التعبير الجيني أظهرت التعبير التفاضلي من الجينات علامة لعظم ، والخلايا العظمية ، والعظم ، والغضروفي. كما تم عزل الحمض الريبي عالي الجودة من مجموعه من الانسجه والاعمار الجنينية. هذا البروتوكول تفاصيل اعداد العينة ل LCM بما في ذلك كريومبيدينج ، التقطيع ، تلطيخ وتجفيف الانسجه المجمدة الطازجة ، وعزل دقيق من الغضروف والعظم من قبل LCM مما ادي إلى الحمض الريبي النيبالي عاليه الجودة للتحليل الناسخ.
الجهاز العضلي الهيكلي هو نظام متعدد المكونات يتكون من العضلات, النسيج الضام, وتر, الرباط, الغضروف, والعظام, العصبية من الأعصاب والاوعيه الدموية بواسطة أوعيه دموية1. تتطور انسجه الهيكل العظمي مع زيادة التغاير الخلوي والتعقيد الهيكلي. الغضروف والعظام تتطور من نفس النسب أوستيوتشوندروبروجينيتور وذات الصلة للغاية. الغضروف الجنيني والعظام تتطور بالتعاون مع العضلات والأعصاب والاوعيه الدموية ، وغير متمايزة مسسبي. ويمكن أيضا ان يكون الغضروف محاطا بالعظم ، مثل غضروف ميكيل والغضروف المخروطي داخل عظم الفك. هذه الانسجه هي المرتبطة تشريحيا وتتفاعل مع بعضها البعض من خلال إشارات خارج الخلية اثناء التنمية. في دراسة التعبير الجيني في تطوير الغضروف والعظام ، عقبه واحده هي تغاير الهياكل الهيكلية التي تتالف من أنواع متعددة من الانسجه. العزل الدقيق للانسجه المحددة ذات الاهتمام هو المفتاح للتحليل الناجح للتحويل.
التشريح المجهري للتقاط الليزر (LCM) هو أداه قويه لعزل أنواع الخلايا أو مناطق الاهتمام داخل الانسجه غير المتجانسة ، وهي قابله للتكرار وحساسة لمستوي الخلية الواحدة2. يمكن ان تستهدف بدقه والتقاط الخلايا من الفائدة لمجموعه واسعه من الاختبارات المصب في النسخ ، والجينوم ، وبروبروتيميكس3،4. ويمكن تقييم نوعيه الحمض النووي الريبي المعزول أو الدنا أو البروتين باستخدام محلل حيوي أو منصة مكافئه. مثلا, [رنا] أشرت نوعيه ب ال [رنا] نزاهة رقم ([رين])5.
هنا ، ونحن نقدم بروتوكول لتلطيخ السريع والعزلة من الغضروف والعظام من قبل LCM من الانسجه المجمدة الطازجة. نحن نستخدم الجنين الفار لإثبات ان هذا البروتوكول غله عاليه الجودة الجيش النيبالي الممتاز للتحليل اللاحقة الناسخ ، مثل التسلسل RNA (RNA-seq).
يتيح LCM عزل الخلايا المخصبة أو متجانسة من الانسجه غير المتجانسة. وتشمل مزاياه القبض السريع والدقيق للخلايا في سياقها المجري ، في حين ان المساوئ المحتملة تشمل ان تكون مضيعه للوقت ، ومكلفه ، ومحدوده بالحاجة إلى ان يتعرف المستخدم علي السكان الفرعيين المتميزين ضمن عينه محدده30</s…
The authors have nothing to disclose.
وقد دعم هذا العمل المعهد الوطني لبحوث طب الأسنان والجمجمة (R01DE022988) ومعهد يونيس كينيدي شريفر الوطني لصحة الطفل والتنمية البشرية (P01HD078233). ويشكر المؤلفون المستودع الحيوي والامراض الاساسيه للوصول إلى منصة لأيكا LMD 6500 في مدرسه Icahn للطب في جبل سيناء.
2-Methylbutane | ThermoFisher Scientific | O3551-4 | |
Bioanalyzer | Agilent | G2939BA | |
Centrifuge tube | ThermoFisher Scientific | 339653 | Conical sterile polypropylene centrifuge tubes, 50 mL |
Cresyl violet acetate | Sigma-Aldrich | C5042 | |
Cryostat | Leica Biosystems | CM3050 S | |
Delicate task wiper | ThermoFisher Scientific | 06-666 | |
Disposable embedding mold | ThermoFisher Scientific | 1220 | |
Distilled water | Invitrogen | 10977-015 | DNase/RNase-Free |
Ethanol, absolute (200 proof) | ThermoFisher Scientific | BP2818 | Molecular biology grade |
Glass PEN membrane slide | Leica Microsystems | 11505158 | |
LCM system | Leica Microsystems | Leica LMD6500 | |
Microscope cover glass | ThermoFisher Scientific | 12-545FP | |
Microscope slides | ThermoFisher Scientific | 12-550-15 | |
OCT compound | Electron Microscopy Sciences | 102094-106 | |
PCR tube with flat cap, 0.5 mL | Axygen | PCR-05-C | LCM collection tubes |
Permanent mounting medium | Vector Laboratories | H-5000 | |
RNA isolation kit | ThermoFisher Scientific | KIT0204 | |
RNase decontamination agent | Sigma-Aldrich | R2020 | RNase decontamination agent for cleaning surfaces |
Xylene | Sigma-Aldrich | 214736 |