الليزر التقاط ميكروتشريح الغضروف الجنيني الماوس والعظام لتحليل التعبير الجيني
Summary
يصف هذا البروتوكول التشريح المجهري للتقاط الليزر لعزل الغضروف والعظم من الأجزاء المجمدة الطازجة من جنين الفاره. الغضروف والعظم يمكن تصورها بسرعة بواسطة تلطيخ البنفسج كريريل وجمعت علي وجه التحديد لإنتاج الحمض الريبي النيبالي عاليه الجودة للتحليل الناسخ.
Abstract
التشريح المجهري للتقاط الليزر (LCM) هو أداه قويه لعزل أنواع الخلايا المحددة أو المناطق ذات الاهتمام من الانسجه غير المتجانسة. التعقيد الخلوي والجزيئي للعناصر الهيكل العظمي يزيد مع التنمية. تغاير الانسجه ، مثل في واجهه العناصر الغضروفية والعظمية مع بعضها البعض أو مع الانسجه المحيطة بها ، هو عقبه واحده لدراسة تطوير الغضروف والعظام. بروتوكولنا يوفر طريقه سريعة لمعالجه الانسجه وعزل الغضروف والعظام التي تعطي الحمض الريبي النيبالي عاليه الجودة لتحليل التعبير الجيني. يتم تقسيم الانسجه المجمدة الطازجة من الاجنه الماوس ويتم استخدام قصيرة البنفسجية التلون الأرجواني لتصور الغضروف والعظم مع ألوان المتميزة من الانسجه المحيطة بها. ثم يتم تجفيف الشرائح بسرعة ، ويتم عزل الغضروف والعظم في وقت لاحق من قبل LCM. التقليل من التعرض للحلول المائية اثناء هذه العملية يحافظ علي سلامه الحمض الريبي النيبالي. تم جمع بنجاح الغضروف الماوس Meckel وعظم فك في E 16.5 وتحليل التعبير الجيني أظهرت التعبير التفاضلي من الجينات علامة لعظم ، والخلايا العظمية ، والعظم ، والغضروفي. كما تم عزل الحمض الريبي عالي الجودة من مجموعه من الانسجه والاعمار الجنينية. هذا البروتوكول تفاصيل اعداد العينة ل LCM بما في ذلك كريومبيدينج ، التقطيع ، تلطيخ وتجفيف الانسجه المجمدة الطازجة ، وعزل دقيق من الغضروف والعظم من قبل LCM مما ادي إلى الحمض الريبي النيبالي عاليه الجودة للتحليل الناسخ.
Introduction
الجهاز العضلي الهيكلي هو نظام متعدد المكونات يتكون من العضلات, النسيج الضام, وتر, الرباط, الغضروف, والعظام, العصبية من الأعصاب والاوعيه الدموية بواسطة أوعيه دموية1. تتطور انسجه الهيكل العظمي مع زيادة التغاير الخلوي والتعقيد الهيكلي. الغضروف والعظام تتطور من نفس النسب أوستيوتشوندروبروجينيتور وذات الصلة للغاية. الغضروف الجنيني والعظام تتطور بالتعاون مع العضلات والأعصاب والاوعيه الدموية ، وغير متمايزة مسسبي. ويمكن أيضا ان يكون الغضروف محاطا بالعظم ، مثل غضروف ميكيل والغضروف المخروطي داخل عظم الفك. هذه الانسجه هي المرتبطة تشريحيا وتتفاعل مع بعضها البعض من خلال إشارات خارج الخلية اثناء التنمية. في دراسة التعبير الجيني في تطوير الغضروف والعظام ، عقبه واحده هي تغاير الهياكل الهيكلية التي تتالف من أنواع متعددة من الانسجه. العزل الدقيق للانسجه المحددة ذات الاهتمام هو المفتاح للتحليل الناجح للتحويل.
التشريح المجهري للتقاط الليزر (LCM) هو أداه قويه لعزل أنواع الخلايا أو مناطق الاهتمام داخل الانسجه غير المتجانسة ، وهي قابله للتكرار وحساسة لمستوي الخلية الواحدة2. يمكن ان تستهدف بدقه والتقاط الخلايا من الفائدة لمجموعه واسعه من الاختبارات المصب في النسخ ، والجينوم ، وبروبروتيميكس3،4. ويمكن تقييم نوعيه الحمض النووي الريبي المعزول أو الدنا أو البروتين باستخدام محلل حيوي أو منصة مكافئه. مثلا, [رنا] أشرت نوعيه ب ال [رنا] نزاهة رقم ([رين])5.
هنا ، ونحن نقدم بروتوكول لتلطيخ السريع والعزلة من الغضروف والعظام من قبل LCM من الانسجه المجمدة الطازجة. نحن نستخدم الجنين الفار لإثبات ان هذا البروتوكول غله عاليه الجودة الجيش النيبالي الممتاز للتحليل اللاحقة الناسخ ، مثل التسلسل RNA (RNA-seq).
Protocol
Representative Results
Discussion
يتيح LCM عزل الخلايا المخصبة أو متجانسة من الانسجه غير المتجانسة. وتشمل مزاياه القبض السريع والدقيق للخلايا في سياقها المجري ، في حين ان المساوئ المحتملة تشمل ان تكون مضيعه للوقت ، ومكلفه ، ومحدوده بالحاجة إلى ان يتعرف المستخدم علي السكان الفرعيين المتميزين ضمن عينه محدده30</s…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد دعم هذا العمل المعهد الوطني لبحوث طب الأسنان والجمجمة (R01DE022988) ومعهد يونيس كينيدي شريفر الوطني لصحة الطفل والتنمية البشرية (P01HD078233). ويشكر المؤلفون المستودع الحيوي والامراض الاساسيه للوصول إلى منصة لأيكا LMD 6500 في مدرسه Icahn للطب في جبل سيناء.
Materials
| 2-Methylbutane | ThermoFisher Scientific | O3551-4 | |
| Bioanalyzer | Agilent | G2939BA | |
| Centrifuge tube | ThermoFisher Scientific | 339653 | Conical sterile polypropylene centrifuge tubes, 50 mL |
| Cresyl violet acetate | Sigma-Aldrich | C5042 | |
| Cryostat | Leica Biosystems | CM3050 S | |
| Delicate task wiper | ThermoFisher Scientific | 06-666 | |
| Disposable embedding mold | ThermoFisher Scientific | 1220 | |
| Distilled water | Invitrogen | 10977-015 | DNase/RNase-Free |
| Ethanol, absolute (200 proof) | ThermoFisher Scientific | BP2818 | Molecular biology grade |
| Glass PEN membrane slide | Leica Microsystems | 11505158 | |
| LCM system | Leica Microsystems | Leica LMD6500 | |
| Microscope cover glass | ThermoFisher Scientific | 12-545FP | |
| Microscope slides | ThermoFisher Scientific | 12-550-15 | |
| OCT compound | Electron Microscopy Sciences | 102094-106 | |
| PCR tube with flat cap, 0.5 mL | Axygen | PCR-05-C | LCM collection tubes |
| Permanent mounting medium | Vector Laboratories | H-5000 | |
| RNA isolation kit | ThermoFisher Scientific | KIT0204 | |
| RNase decontamination agent | Sigma-Aldrich | R2020 | RNase decontamination agent for cleaning surfaces |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 214736 |
Referencias
- Kardon, G. Development of the musculoskeletal system: Meeting the neighbors. Development. 138 (14), 2855-2859 (2011).
- Nichterwitz, S., Chen, G., et al. Laser capture microscopy coupled with Smart-seq2 for precise spatial transcriptomic profiling. Nature Communications. 7, 12139 (2016).
- Liu, A. Laser capture microdissection in the tissue biorepository. Journal of Biomolecular Techniques. 21 (3), 120-125 (2010).
- Datta, S., et al. Laser capture microdissection: Big data from small samples. Histology and Histopathology. 30 (11), 1255-1269 (2015).
- Schroeder, A., Mueller, O., et al. The RIN: An RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Molecular Biology. 7 (3), (2006).
- Motch Perrine, S. M., Wu, M., et al. Mandibular dysmorphology due to abnormal embryonic osteogenesis in FGFR2-related craniosynostosis mice. Disease Models & Mechanisms. 12 (5), (2019).
- Holmes, G., O’Rourke, C., et al. Midface and upper airway dysgenesis in FGFR2-craniosynostosis involves multiple tissue-specific and cell cycle effects. Development. 145 (19), (2018).
- Ewels, P., Magnusson, M., Lundin, S., Käller, M. MultiQC: Summarize analysis results for multiple tools and samples in a single report. Bioinformatics. 32 (19), 3047-3048 (2016).
- Tromp, G., Kuivaniemi, H., et al. Structure of a full-length cDNA clone for the preproα1(I) chain of human type I procollagen. Biochemical Journal. 253 (3), 919-922 (1988).
- De Wet, W., Bernard, M., et al. Organization of the human pro-alpha 2(I) collagen gene. Journal of Biological Chemistry. 262 (33), 16032-16036 (1987).
- Bonewald, L. F. The amazing osteocyte. Journal of Bone and Mineral Research. 26 (2), 229-238 (2011).
- Toyosawa, S., Shintani, S., et al. Dentin matrix protein 1 is predominantly expressed in chicken and rat osteocytes but not in osteoblasts. Journal of Bone and Mineral Research. 16 (11), 2017-2026 (2001).
- Guo, D., et al. Identification of osteocyte-selective proteins. Proteomics. 10 (20), 3688-3698 (2010).
- Ducy, P., Zhang, R., Geoffroy, V., Ridall, A. L., Karsenty, G. Osf2/Cbfa1: A transcriptional activator of osteoblast differentiation. Cell. 89 (5), 747-754 (1997).
- Nakashima, K., Zhou, X., et al. The novel zinc finger-containing transcription factor osterix is required for osteoblast differentiation and bone formation. Cell. 108 (1), 17-29 (2002).
- Termine, J. D., et al. Osteonectin, a bone-specific protein linking mineral to collagen. Cell. 26 (1), 99-105 (1981).
- Baldwin, C. T., Reginato, A. M., Prockop, D. J. A new epidermal growth factor-like domain in the human core protein for the large cartilage-specific proteoglycan. Evidence for alternative splicing of the domain. Journal of Biological Chemistry. 264 (27), 15747-15750 (1989).
- Strom, C. M., Upholt, W. B. Isolation and characterization of genomic clones corresponding to the human type II procollagengene. Nucleic Acids Research. 12 (2), 1025-1038 (1984).
- Ninomiya, Y., Olsen, B. R. Synthesis and characterization of cDNA encoding a cartilage-specific short collagen. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 81 (10), 3014-3018 (1984).
- Muragaki, Y., Mariman, E. C. M., et al. A mutation in the gene encoding the alpha 2 chain of the fibril-associated collagen IX, COL9A2, causes multiple epiphyseal dysplasia (EDM2). Nature Genetics. 12 (1), 103-105 (1996).
- Brewton, R. G., Wood, B. M., et al. Molecular cloning of the alpha 3 chain of human type IX collagen: linkage of the gene COL9A3 to chromosome 20q13.3. Genomics. 30 (2), 329-336 (1995).
- Newton, G., Weremowicz, S., et al. Characterization of human and mouse cartilage oligomeric matrix protein. Genomics. 24 (3), 435-439 (1994).
- Hiraki, Y., Mitsui, K., et al. Molecular cloning of human chondromodulin-I, a cartilage-derived growth modulating factor, and its expression in Chinese hamster ovary cells. European Journal of Biochemistry. 260 (3), 869-878 (1999).
- Smits, P., Li, P., et al. The transcription factors L-Sox5 and Sox6 are essential for cartilage formation. Developmental Cell. 1 (2), 277-290 (2001).
- Hayman, A. R., Jones, S. J., et al. Mice lacking tartrate-resistant acid phosphatase (Acp 5) have disrupted endochondral ossification and mild osteopetrosis. Development. 122 (10), 3151-3162 (1996).
- Dai, X. -. M., Ryan, G. R., et al. Targeted disruption of the mouse colony-stimulating factor 1 receptor gene results in osteopetrosis, mononuclear phagocyte deficiency, increased primitive progenitor cell frequencies, and reproductive defects. Blood. 99 (1), 111-120 (2002).
- Gowen, M., Lazner, F., et al. Cathepsin K knockout mice develop osteopetrosis due to a deficit in matrix degradation but not demineralization. Journal of Bone and Mineral Research. 14 (10), 1654-1663 (1999).
- Faccio, R., Takeshita, S., Zallone, A., Ross, F. P., Teitelbaum, S. L. c-Fms and the αvβ3 integrin collaborate during osteoclast differentiation. Journal of Clinical Investigation. 111 (5), 749-758 (2003).
- Kim, N., Takami, M., Rho, J., Josien, R., Choi, Y. A novel member of the leukocyte receptor complex regulates osteoclast differentiation. The Journal of Experimental Medicine. 195 (2), 201-209 (2002).
- Mahalingam, M. Laser Capture Microdissection: Insights into Methods and Applications. Methods in Molecular Biology. 11723, 1-17 (2018).
- Goldsworthy, S. M., Stockton, P. S., Trempus, C. S., Foley, J. F., Maronpot, R. R. Effects of fixation on RNA extraction and amplification from laser capture microdissected tissue. Molecular Carcinogenesis. 25 (2), 86-91 (1999).
- Clément-Ziza, M., Munnich, A., Lyonnet, S., Jaubert, F., Besmond, C. Stabilization of RNA during laser capture microdissection by performing experiments under argon atmosphere or using ethanol as a solvent in staining solutions. RNA. 14 (12), 2698-2704 (2008).
- Farris, S., Wang, Y., Ward, J. M., Dudek, S. M. Optimized method for robust transcriptome profiling of minute tissues using laser capture microdissection and low-input RNA-seq. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 185 (2017).
- Espina, V., Heiby, M., Pierobon, M., Liotta, L. A. Laser capture microdissection technology. Expert Review of Molecular Diagnostics. 7 (5), 647-657 (2007).
- Martuscello, R. T., Louis, E. D., Faust, P. L. A stainless protocol for high quality RNA isolation from laser capture microdissected Purkinje cells in the human post-mortem cerebellum. Journal of Visualized Experiments. (143), (2019).
- Bevilacqua, C., Makhzami, S., Helbling, J. C., Defrenaix, P., Martin, P. Maintaining RNA integrity in a homogeneous population of mammary epithelial cells isolated by Laser Capture Microdissection. BMC Cell Biology. 11 (95), (2010).
- Takahashi, N., Tarumi, W., Hamada, N., Ishizuka, B., Itoh, M. T. Cresyl violet stains mast cells selectively: Its application to counterstaining in immunohistochemistry. Zoological Science. 34 (2), 147-150 (2017).
- Sheldon, A. R., Almli, L., Ferriero, D. M. Copper/zinc superoxide dismutase transgenic brain in neonatal hypoxia-ischemia. Methods in Enzymology. 353, 389-397 (2002).
- Kolijn, K., Van Leenders, G. J. L. H. Comparison of RNA extraction kits and histological stains for laser capture microdissected prostate tissue. BMC Research Notes. 9, 17 (2016).
- Cummings, M., et al. A robust RNA integrity-preserving staining protocol for laser capture microdissection of endometrial cancer tissue. Analytical Biochemistry. 416 (1), 123-125 (2011).
- Filliers, M., et al. Laser capture microdissection for gene expression analysis of inner cell mass and trophectoderm from blastocysts. Analytical Biochemistry. 408 (1), 169-171 (2011).
- Vandewoestyne, M., et al. Laser capture microdissection: Should an ultraviolet or infrared laser be used?. Analytical Biochemistry. 439 (2), 88-98 (2013).
- Ayturk, U. RNA-seq in skeletal biology. Current Osteoporosis Reports. 17 (4), 178-185 (2019).
- Van Den Brink, S. C., et al. Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations. Nature Methods. 14 (10), 935-936 (2017).
- Adam, M., Potter, A. S., Potter, S. S. Psychrophilic proteases dramatically reduce single-cell RNA-seq artifacts: A molecular atlas of kidney development. Development. 144 (19), 3625-3632 (2017).
- Chen, J., et al. Spatial transcriptomic analysis of cryosectioned tissue samples with Geo-seq. Nature Protocols. 12 (3), 566-580 (2017).
