Summary

인간화 면역 결핍 마우스 모델에서 만성, 급성 및 재활성화 HIV 감염

Published: December 03, 2019
doi:

Summary

여기에 기술된 것은 인간화된 마우스에 있는 HIV 감염의 역학을 공부하기 위한 3개의 실험적인 접근입니다. 첫 번째는 만성 감염 사건의 연구를 허용하는 반면, 두 후자는 1 차감염 또는 바이러스 재활성화 후 급성 사건의 연구를 허용합니다.

Abstract

인간화 된 NOD/SCID/IL-2 수용체 γ-chainnull 마우스는 전염병에 대한 기본 및 전임상 연구에서 악용될 수 있는 인간 면역의 일부 특징을 다시 한번 재현합니다. 여기에 설명된 HIV 감염의 역학을 연구하기 위한 인간화된 면역 결핍 마우스의 3가지 모델입니다. 첫 번째는 신생아 마우스에서 CD34+ 조혈 줄기 세포의 간간 주사에 기초, 이는 여러 혈액과 림프 조직 제한된 세포의 재구성을 허용, 참조 HIV 변형감염 뒤에. 이 모델은 감염 후 최대 36주 동안 모니터링할 수 있으므로 만성 모델이라고 합니다. 두 번째 및 세 번째 모델은 말초 혈액 단핵 세포가 성인 마우스에서 복강 내 주입되는 급성 및 재활성화 모델로 지칭됩니다. 급성 모델에서 건강한 기증자의 세포는 복강 내 경로를 통해 이식되고 참조 HIV 균주를 가진 감염이 뒤따릅니다. 마지막으로, 재활성화 모델에서, 항레트로바이러스 요법하에 HIV에 감염된 기증자의 세포는 복강 내 경로를 통해 이식된다. 이 경우 마우스의 약물없는 환경은 바이러스 재활성화 및 바이러스 부하의 증가를 허용합니다. 여기에 제공된 프로토콜은 HIV 감염의 인간화되고 면역 결핍 마우스 모델에 대한 기존의 실험 접근법을 설명합니다.

Introduction

인간화된 NOD/SCID/인터류키친(IL)-2 수용체 γ-chainnull(이하 huNS γ-chainnull로지칭) 마우스 모델은 감염, 자가면역 및 암의 발병기전을 연구하는 데 널리 사용되어 왔으며, 약물 및 인간 세포 기반 치료법의 전임상 연구를 위해1,2. 이들 마우스는 비비만 당뇨병(NOD) 배경을 기반으로 하며, IL-2 수용체 γ-사슬 궤적(IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 및 IL-21)에서 의한 좌약 돌연변이 및 표적 돌연변이(NK)의 발달에 심각한 손상을 유발한다. 따라서, 이들은 인간 조직, 인간 CD34+ 조혈 줄기 세포(HSC) 및 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)의 생착을 지지한다3,4,5. 또한, 줄기세포 인자(SCF), 과립구체/대식세포-콜로니-자극 인자(GM-CSF) 및 IL-3와 같은 인간 조혈계의 형질전환 발현은 인간 골수성 집단의 생착을 촉진한다6,7,8.

HIV 연구를 위해, 몇몇 huNS γ 사슬 마우스 모형은 마우스 긴장, 사용된 인간 세포의 모형, 생착을 위한 조직의 모형 및 세포의 기원에 다른 기술되었습니다 (즉, 건강한 대. HIV에 감염된 기증자)9,10. 본래의 균주는, 그러나, 참조 HIV 균주11,12,13을가진 감염 다음 인간 세포 생착 및 바이러스 복제의 상부 때문에 널리 사용된다. 인간 조혈 인자의 형질전환 발현을 가진 유사한 면역 결핍 마우스 긴장 (예를 들어, NOG-EXL 또는 NSG-SGM3) 또는 인간 간 및 흉선 조직(골수 간-흉선[BLT] 마우스)의 임플란트와 함께 항 HIV 면역 반응에서 골수성 집단의 역할, 이들 조직에 대한 HIV의 영향, 및 바이러스 성 저수지로서의 그들의 참여에 유용하다14,15. 더욱이, BLT 마우스뿐만 아니라 인간 백혈구 항원(HLA) 분자의 형질전환 발현을 가진 일부 균주는 HIV 감염에 대한 T 세포 반응을 연구하기 위해 사용될 수 있다16,17.

일반적으로, 이들 마우스에서, 인간화는 세포 기원, 전달 경로(복강내, 간내, 정맥내, 심장내) 및 생착시의 마우스 나이에 따라 달라지며18,19,20. 세포 기원에 관하여, 제대혈, 태아 간, 또는 동원된 말초 혈액으로부터 유래된 인간CD34+ HSC는 신생아 또는 젊은 마우스3,21에주사될 수 있다. 또한, 성인 γ-사슬 마우스는 PBMC(여기서 hu-PBL-NS γ-chainnull 마우스라고 함)의 주입에 의해 인간화될 수 있으며, 이들 세포의 혈액, 이차 림프기관 및 염증조직(22,23,24)의시간적 순환을 허용한다.

여기서 설명된 것은 HIV 감염의 연구를 위한 huNS γ-chain 마우스 모델의 확립을 위한 상세한 프로토콜이다. 첫 번째는 만성 모델이며, 건강한 기증자로부터 코드 혈액에서 파생 된 인간 CD34+ HSC가 신생아 마우스에 주입되고, 인간 면역 체계 재구성 14 주 후에 참조 HIV 균주를 가진 감염이 뒤따릅니다. 이 모형은 감염 후에 최대 ~36 주 동안 마우스의 감시를 허용합니다. 두 번째 모델은 건강한 공여자로부터 유래된 PBMC가 성인 NS γ-chainnull 마우스에 주입되고, 마우스에서 인간 T 세포 확장 3주 후에 참조 HIV 균주를 가진 감염이 뒤따르는 급성 모델이다. 마지막으로, 제3 모델은 억제항레트로바이러스 요법(ART)에 따라 HIV 감염 공여자로부터 유래된 PBMC가 성인 NS γ-chainnull 마우스에 주입되는 재활성화 모델이다. 이 경우 약물이없는 환경은 바이러스 재활성화 및 바이러스 부하 증가를 허용합니다. 두 후자의 모델은 생착 후 ~ 9 주까지 모니터링 할 수 있습니다.

전반적으로, 이 3개의 모형은 바이러스학 연구, 새로운 약의 전임상 연구 및 글로벌 면역 반응에 HIV 감염 효력의 평가를 위해 유용합니다. 또한 HIV에 감염된 인간화 마우스의 사용은 어떤 실험든지 전에 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의하여 기관 생물 안전위원회 (IBC)에 의하여 검토 그리고 승인을 요구한다는 것을 고려하는 것이 중요합니다. 이것은 연구가 실험 동물의 위험한 생물학적 물질의 사용과 인도적 취급에 대한 모든 내부 및 외부 기관 규정을 준수할 수 있도록 합니다.

Protocol

이 작품에서, 모든 동물 관리 및 절차는 메릴랜드 의과 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 검토되고 승인 된 프로토콜에 따라 수행되었습니다 (프로토콜 번호 1018017, 1018018, 및 0318009). 1. 신생아 생쥐의 인간 CD34+ HSC 생착 멸균 스크럽, 장갑, 전용 신발, 신발 커버, 마스크, 고글, 머리/수염 보닛 및 멸균 실험실 코트를 포함하여 일회용 개인 보호 ?…

Representative Results

전술한 바와 같이, HSC 주사 후 14주(만성 모델) 또는 3주 후 PBMC 주사(급성 및 재활성화 모델)에서, 마우스는 유동 세포측정에 의한 인간 세포 생착의 수준을 스크리닝하기 위해 피를 흘린다. 1) 인간 CD45+ 세포 재구성 및 2)CD4+ 및CD8+ T 세포의 백분율의 평가를 위한 대표적인 게이팅 전략은 도 1A에도시되어 있다. 전형적으로, 생착의 수준(인간…

Discussion

인간화를 위한 면역결핍 마우스 균주의 발달에서 중요한 진전이 이루어졌으며, 연구 관심사1에따라 사용될 수 있는 다양한 옵션들이 있다. 여기에 제공된 NS γ-chainnull 마우스 및 유전적으로 유사한 균주의 인간화를 위한 일반적인 프로토콜은 HIV 감염을 연구하기 위한 3개의 상이한 모델에서 채택될 것이다. 제1 실험 접근법에서, 조사된 신생아 마우스는 인간CD34+

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 작품은 JCZ에 IHV 임상 부문 내부 자금에 의해 지원되었다.

Materials

0. 5 ml Microcentrifuge tubes Neptune 3735.S.X
1. 5 ml Microcentrifuge tubes Neptune 3745.S.X
10 ml Serologial pipetes stellar sceintific VL-4090-0010
15 ml conical tubes Stellar scientific T15-600
25 ml Serologial pipetes stellar sceintific VL-4090-0025
5 ml Serologial pipetes stellar sceintific VL-4090-0005
50 ml conical tubes Stellar scientific T50-600
ACK lysis buffer Quality biological 118-156-101
Alcohol prep pads Fisher scientific 06-669-62 Sterile
Anti-Human CD3 clone UCHT1 Biolegend 300439 APC conjugated
Anti-Human CD4 clone OKT4 Biolegend 317420 AF488 conjugated
Anti-Human CD45 clone 2D1 Biolegend 368522 BV421 conjugated
Anti-Human CD8 clone SK1 Biolegend 344710 PerCP-Cy5.5 conjugated
Biosafaty cabinet level 2 If posible connected to an exauste chimeny when handling Isoflurane
Bonnet Fisher scientific 17-100-900 Single use cap for basic protection
Cavicide Metrex 13-1000 Surface desinfectant
CD34+ cells Lonza 2C-101 As many vials available from a single donor
Centrifuge Beckman 65-6KR
Clear jar Amazon 77977
Cotton gauze pad Fisher scientific 22-415-468 Sterile
Disposable lab coats Fisher scientific 19-472-422
EDTA micro tubes Greiner bio-one 450480
Face Mask Fisher scientific 17-100-897
FACS lysing solution BD 340202
FBS premium HI Atlanta biologicals S1115OH
Ficoll GE health one 17-1440-02
Flow cytometer We used FACS Aria II
Flow cytometry tubes Falcon 352054 5 ml polystyrene and round bottom
HIV BaL Prepared in our uQUANT core facility
Human PBMCs HIV positive and negative volunteers
Infrared warming pad Venet scientific DCT-25 Temporary therapeutic warming pad for small animals
Isentress (Raltegravir) Merck NSC 0006-0227061 Antiretroviral medication to treat human immunodeficiency virus (HIV)-Integrase inhibitor
Isoflurane Henry Schein NDC 11695-6776-2
Mark I irradiator Equipment belonging to university of Maryland
Micro pipettes
Microcentrifuge Eppendorf
Mouse ear tags National Band & Tag company 1005-1L1
Natelson blood collection tubes Fisher scientific 02-668-10
NOG-EXL Taconic HSCFTL-13395-F
NSG mice Jackson 5557 Time pregnant females for CD34 engraftment and Juveniles for PBMCs engraftment
NSG-SGM3 Jackson 13062
Paraformaldehyde 16% Electron microscopy sciences 15710
PBS 1X pH 7.4 Gibco 100-10-023
Petri dishes Fisher scientific 08-757-28
Quantistudio qPCR machine Thermo QS3
Reagent reservoirs Costar 4870
RPMI media 1640 1X Gibco 11875-093
Shoe covers Fisher scientific 17-100-911
Sterile disposable Gloves Microflex SUF-524
SuperScript II First-Strand Synthesis SuperMix Invitrogen 10080-400 cDNA synthesis
Syringes 28-G x 1/2 BD 329-461
Syringes 29-G x 1/2 BD 324-702
Truvada (Emtricitabine and Tenofovir Gilead NDC 61958-0701-1 Antiretroviral medication to treat human immunodeficiency virus (HIV)-Nicleoside analog-transcriptase inhibitor
Trypan blue Sigma T8154 Cell count and viability
Vick Vaporub School health 43214 Ointment based on menthol and eucalyptus
Water molecular biology grade Quality biological 351-029-131

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Perdomo-Celis, F., Medina-Moreno, S., Heredia, A., Davis, H., Bryant, J., Zapata, J. C. Chronic, Acute, and Reactivated HIV Infection in Humanized Immunodeficient Mouse Models. J. Vis. Exp. (154), e60315, doi:10.3791/60315 (2019).

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