ヒト幹細胞由来内皮細胞およびGABAergicニューロンの移動、化学誘引、共培養アッセイ

内皮細胞は血管の内層を形成し、血管壁透過性の維持、血流の調節、血小板凝集、新しい血管の形成を含む重要な機能を仲介する。脳では、内皮細胞は脳と血流との間の物質交換を緊密に制御する重要な血液脳関門の一部を形成する^1.過去10年間の我々の研究は、脳の発達と行動に重要な意味を持つ脳内皮細胞の新しい神経原性の役割を同定しました^2,3,4,5.我々は、マウス胚前脳が、解剖学、起源、および発達プロファイル^において異なる2つの異なる血管、第二の血管、心血管および心室血管によって血管化されることを示した。これらの2つの血管サブタイプを裏打ちする内皮細胞は、それらの遺伝子発現プロファイルに明確な違いを示す。ピアリン内皮細胞は主に炎症や免疫応答に関連する遺伝子を発現するが、心室内皮細胞は神経新生、神経細胞移動、化学療法、および軸索誘導^体に一般的に関連する遺伝子の発現において一意に富化される。心室外皮細胞はまた、従来の神経神経神経GABAシグナル経路⁵とは異なる新規GABAシグナル伝達経路を収容する。その遺伝子発現と共に、脳室内皮細胞は、発達中の新皮質におけるGABAergicインターニューロンの移動および分布を調節することが判明した。胚発生中、心室内皮細胞は腹側側側心筋勾配に沿って長距離移動を行い、心室血管ネットワーク^2,3を確立する。この回遊経路は、インターニューロンによって1日後にミラーリングされます。移動インターニューロンは、事前に形成された心室血管ネットワークと物理的に相互作用し、新皮質の最終目的地に到達するためのガイドレールとしてそれを使用する。物理的な基質として作用することに加えて、心室内皮細胞は、ニューロンを移動するためのナビゲーションキューの源として機能する。心室内皮細胞分泌GABAガイドインターニューロン移動をガイドし、その最終的な分布パターンを調節する⁴.ニューロン間移動および分布の欠陥は、自閉症、てんかん、統合失調症およびうつ病^{6、7、8、9、10}などの神経精神障害^に関連付けられている。従って、人間の文脈における神経間移動に対する心室内皮細胞機能およびそれらの影響の研究は、これらの疾患の病態に対処するために重要となる。

我々は、人工多能性幹細胞(iPSC)技術^12,13を用いて、ヒト胚性幹細胞からヒトの心室様内皮細胞を生成した。ヒト心室外皮細胞がマウスの心室内皮細胞を忠実に模倣しているかどうかを検証し、ニューロン間移動への影響を定量的に評価するために、遠隔移動アッセイ、共培養移行アッセイ、化学誘致アッセイの3つのインビトロアッセイを開発しました。ここでは、これらのアッセイのプロトコルについて詳しく説明します。3つのアッセイはすべて、シリコーン培養インサートの使用に基づいて、セルフリースペースで囲まれたセルの小さな長方形パッチ(固定寸法)を作成します。移動距離は、0日目に輪郭が描かれた矩形パッチの境界から細胞の最終的な位置間の距離を測定することによって評価される。長距離移動アッセイでは、ヒト心室内皮細胞を35mm皿の中心にパッチとして播種し、長い時間にわたって細胞が移動した距離を計算する。共培養移動アッセイでは、ヒト心室内皮細胞を35mm皿に1つのパッチとしてヒトインターニューロンと共播する。このセットアップは、インターニューロンの移動速度に対するこれら2つの細胞型の直接的な物理的相互作用の影響の検査を可能にする。ケモアチーバレンスアッセイは、ヒト心室内皮細胞によって分泌されるケモ魅力的な手がかりに応答して、ニューロン間の移動を測定する。インターニューロンは、ヒトの心室内皮細胞を有する長方形パッチとして播種され、両側に同様のサイズのパッチとして播種された非心室内皮細胞を制御する。各細胞パッチは、500μmの無細胞ギャップによって分離される。インターニューロンの応答は、非心室内皮細胞を制御することと比較して、心室内皮細胞に向かって移動した細胞の数を定量することによって評価される。

これらのアッセイは、ヒトの心室内皮細胞機能およびそれらのニューロン間移動への影響について、強固な評価を提供する。長距離アッセイと共培養移行アッセイの新しいセットアップは、長距離移動の検出を可能にするセンチメートル(約1〜1.5cm)の範囲で無細胞スペースを提供します。他の一般的なアッセイと比較したアッセイの特徴の要約を表1に示します。ここで説明するアッセイは、統合失調症、自閉症、てんかんなどの脳障害のiPSPsCから発生する「病気」の心室内皮細胞およびインターニューロンを評価するためのプラットフォームとして機能する。これらのアッセイは、異なる条件(例えば阻害剤、リガンド、RNAi)が細胞の遊入にどのように影響するかを決定するためにも使用することができる。最後に、これらのアッセイは、長距離移動、化学吸引、または細胞媒介性移動を測定するために、他の細胞タイプに最適化することができます。