Obtenção de vesículas híbridas unilamellares gigantes por eletroformação e medição de suas propriedades mecânicas pela aspiração micropipette
Summary
O objetivo do protocolo é medir de forma confiável as propriedades mecânicas da membrana de vesículas gigantes por aspiração micropipette.
Abstract
Vesículas gigantes obtidas a partir de fosfolípidos e polímeros podem ser exploradas em diferentes aplicações: entrega de medicamentos controlados e direcionados, reconhecimento biomolecular dentro de biossensores para diagnóstico, membranas funcionais para células artificiais e desenvolvimento de micro/nanores bioinspirados. Em todas essas aplicações, a caracterização de suas propriedades de membrana é de fundamental importância. Entre as técnicas de caracterização existentes, a aspiração micropipette, pioneira por E. Evans, permite a medição de propriedades mecânicas da membrana, como modulus de compresibilidade de área, modulus de flexão e estresse e tensão de lise. Aqui, apresentamos todas as metodologias e procedimentos detalhados para obter vesículas gigantes a partir da película fina de um lipídico ou copolímero (ou ambos), a fabricação e o tratamento superficial de micropipettes e o procedimento de aspiração que leva à medição de todos os parâmetros mencionados anteriormente.
Introduction
Vesículas gigantes obtidas a partir de fosfolípidos (lipossomos) têm sido amplamente utilizados desde a década de 1970 como o modelo de membrana celular básica1. No final da década de 1990, as morfologias vesiculares obtidas a partir da automontagem de copolímeros, denominadas polimerasias em referência aos seus análogos lipídicos2,3, rapidamente apareceram como uma alternativa interessante aos lipossomas que possuem estabilidade mecânica fraca e má funcionalidade química modular. No entanto, seu caráter biomimético celular é bastante limitado em comparação com os lipossomos, uma vez que estes últimos são compostos de fosfolípidos, o principal componente da membrana celular. Além disso, sua baixa permeabilidade da membrana pode ser um problema em algumas aplicações, como a entrega de drogas, onde a difusão controlada de espécies através da membrana é necessária. Recentemente, a associação de fosfolípidos com polímeros de bloco para projetar vesículas e membranas polímeras-lipídios híbridas tem sido objeto de um número crescente de estudos4,5. A idéia principal é projetar entidades que combinam sinergicamente os benefícios de cada componente (biofuncionalidade e permeabilidade de bicamadas lipídicas com a estabilidade mecânica e versatilidade química das membranas polímeras), que podem ser exploradas em diferentes aplicações: entrega de medicamentos controlados e direcionados, reconhecimento biomolecular dentro de biossensores para diagnóstico, membranas funcionais para células artificiais, desenvolvimento de micro/nano-reatores de inspiração biológica.
Hoje em dia, diferentes comunidades científicas (bioquímicos, químicos, biofísicos, químicos-físicos, biólogos) têm um interesse crescente no desenvolvimento de um modelo de membrana celular mais avançado. Aqui, nosso objetivo é apresentar, o mais detalhado possível, metodologias existentes (eletroformação, aspiração micropipette) para obter e caracterizar as propriedades mecânicas das vesículas gigantes e os recentes modelos de membrana celular “avançada” que são vesículas gigantes lipídicas de polímero híbrido4,5.
O objetivo desses métodos é obter medição confiável da compresibilidade da área e moduli de flexão da membrana, bem como seu estresse e tensão de lyse. Uma das técnicas mais comuns existentes para medir a rigidez de flexão de uma vesícula gigante é a análise de flutuação6,7,com base na observação direta do microscópio de vídeo; mas isso requer grande flutuação visível da membrana, e não é sistematicamente obtido em membranas espessas (por exemplo, polimémersos). Modulus de compresibilidade de área pode ser determinada experimentalmente usando a técnica Langmuir Blodgett, mas na maioria das vezes em um monocamada8. A técnica de aspiração micropipette permite a medição de ambos moduli em um bicamada formando vesícula unilamellar gigante (GUV) em um experimento.
O seguinte método é apropriado para todas as moléculas ou macromoléculas anfofílicas capazes de formar bicamadas e, consequentemente, vesículas por eletroformação. Isso requer um caráter fluido do bicamada à temperatura da eletroformação.
Protocol
Representative Results
Discussion
O revestimento da micropipette é um dos pontos-chave para obter medições confiáveis. A adesão da vesícula à micropipette deve ser evitada, e um revestimento é comumente usado na literatura17,18,19,20,21,com BSA, β-casein ou surfasil. Detalhes do procedimento de revestimento raramente são mencionados.
A dissolução da BSA …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores reconhecem com gratidão a ANR pelo apoio financeiro (ANR Sysa).
Materials
| Required equipment and materials for micropipette design | |||
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100-4 | external and internal diameter of 1mm and 0.58 mm respectively. |
| Filament installed | Sutter Instrument Co. | FB255B | 2.5mm*2.5mm Box Filament |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | Model P-97 | |
| Microforge | NARISHGE Co. | MF-900 | fitted with two objectives (10x and 32x) |
| Materials for coating pipette tips with BSA | |||
| Bovine Serum Albumin Fraction V (BSA) | Sigma-Aldrich | 10735078001 | |
| Disposable 1 ml syringe Luer Tip | Codan | 62.1612 | |
| Disposable 10 ml syringe Luer Tip | Codan | 626616 | |
| Disposable 5 ml syringe Luer Tip | Codan | 62.5607 | |
| Disposable acetate cellulose filter | Cluzeau Info Labo | L5003SPA | Pore size: 0.22µm, diameter: 25mm |
| Flexible Fused Silica Capillary Tubing | Polymicro Technologies. | TSP530660 | Inner Diameter 536µm, Outer Diameter 660µm, |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | |
| Syringe 500 µL luer Lock GASTIGHT | Hamilton Syringe Company | 1750 | |
| Test tube rotatory mixer | Labinco | 28210109 | |
| Micromanipulation Set up | |||
| Aluminum Optical Rail, 1000 mm Length, M4 threads, X48 Series | Newport | ||
| Damped Optical Table | Newport | used as support of microscope to prevent external vibrations. | |
| Micromanipulator | Eppendorf | Patchman NP 2 | The module unit (motor unit for X, Y and Z movement) is mounted on the inverted microscope by the way of an adapter. |
| Micrometer | Mitutoyo Corporation | 350-354-10 | Digimatic LCD Micrometer Head 25,4 mm Range 0,001 mm |
| Plexiglass water reservoir (100 ml) | Home made | ||
| TCS SP5 inverted confocal microscope (DMI6000) equipped with a resonant scanner and a water immersion objective (HCX APO L 40x/0.80 WU-V-I). | Leica | ||
| X48 Rail Carrier 80 mm Length,with 1/4-20, 8-32 and 4-40 thread | Newport | ||
| Materials for sucrose and amphiphile solution preparation | |||
| 2-Oleoyl-1-palmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Sigma-Aldrich | ||
| Chloroform | VWR | 22711.244 | |
| L-α-Phosphatidylethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) | Sigma-Aldrich | 810146C | Rhodamine tagged lipid |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
| Electroformation set up | |||
| 10 µL glass capillary ringcaps | Hirschmann | 9600110 | |
| Disposable 1 ml syringe Luer Tip | Codan | 62.1612 | |
| H Grease | Apiezon | Apiezon H Grease | Silicon-free grease |
| Indium tin oxide coated glass slides | Sigma-Aldrich | 703184 | |
| Needle | Terumo | AN2138R1 | 0.8 x 38 mm |
| Ohmmeter (Multimeter) | Voltcraft | VC140 | |
| Toluene | VWR | 28676.297 | |
| Voltage generator | Keysight | 33210A |
Referencias
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