줄기 세포 유래 바이러스 Ag 특이적 T 림프구는 마우스에서 HBV 복제를 억제
Summary
여기에 제시된 것은 줄기세포 유래 바이러스 항원(Ag)-특이적 T 림프구의 입양세포 전달(ACT)을 이용하여 마우스에서 B형 간염 바이러스(HBV) 복제의 효과적인 억제를 위한 프로토콜이다. 이 절차는 HBV 감염의 잠재적인 ACT 기지를 둔 면역 요법을 위해 적응될 수 있습니다.
Abstract
B형 간염 바이러스 (HBV) 감염은 글로벌 건강 문제입니다. 전 세계적으로 3억 5천만 명 이상이 영향을 받은 HBV 감염은 간암의 주요 원인으로 남아 있습니다. 이것은 특히 개발도상국에서 주요 관심사입니다. HBV에 대하여 효과적인 반응을 탑재하는 면역 계통의 실패는 만성 감염으로 이끌어 냅니다. HBV 백신이 존재하고 새로운 항 바이러스 의약품이 생성되고 있지만, 바이러스 저수지 세포의 박멸은 주요 건강 주제로 남아 있습니다. 여기서 기재된 바이러스 항원(Ag)-특이적CD8+세포독성 T 림프구(CTL)의 생성을 위한 방법은 유도된 만능 줄기 세포(iPSCs)(즉, iPSC-CTL)로부터 유래되며, 이는 HBV 복제를 억제하는 능력을 갖는다. HBV 복제는 HBV 발현 플라스미드, pAAV/HBV1.2의 유체역학적 주입을 통해 마우스에서 효율적으로 유도되며, 간으로 유도된다. 이어서, HBV 표면 Ag 특이적 마우스 iPSC-CTL은 입양적으로 전달되어 간 및 혈액에서의 HBV 복제를 크게 억제할 뿐만 아니라 간세포에서 HBV 표면 Ag 발현을 방지한다. 이 방법은 유체역학적 주입 후 마우스에서 HBV 복제를 입증하고 줄기 세포 유래 바이러스 Ag-특이적 CTLs가 HBV 복제를 억제할 수 있음을 보여준다. 이 프로토콜은 HBV 면역 요법에 유용한 방법을 제공한다.
Introduction
급성 감염 에 이어, 적응 면역 체계 (즉, 체액성 및 세포 면역)는 급성 HBV 관련 간염의 대부분을 제어합니다. 아직도, HBV 풍토성 지구에 있는 사람들의 수는 바이러스를 제거하고 그 후에 만성 개별로 변환할 수 없습니다. 전 세계 만성 환자(>2억 5천만 명)의 25% 이상이 진행성 간 질환을 일으켜 간경변 및/또는 간세포암종(HCC)을 초래합니다1. 그 결과, 고집이 세게 감염된 세포의 박멸은 유효한 백신2가 있고 수많은 항바이러스 약이 개발되고 있더라도 일반적인 건강 문제 남아 있습니다. HBV 감염을 위한 표준 처리는 IFN-α, 뉴클레오시드, 및 뉴클레오티드 유사체를 포함한다. 이 에이전트는 직접적인 항 바이러스 활성 및 면역 조절 용량. 그럼에도 불구하고, HBe 항원(Ag)+담체의 혈청 변환(Ab) 및 혈청 HBV 데옥시리보핵산(DNA)의 손실은 치료된 환자의 약 20%에서 개별적으로 나타나며, 바이러스의 전체 면역학 적 대조군 BBsAg의 박탈에 의해 확인은 더 이상 5 %3입니다. 또한 치료에 대한 반응은 종종 내구성이 없습니다. 재조합 HBs Ag를 가진 예방 백신 접종은 감염 예방에 매우 효과적이지만 치료적 HBs Ag 예방 접종은 효과적이지 않습니다. 명확 하 게, T 세포 매개 면역 반응 HBV 감염 및 간 손상 제어에 중요 한 역; 그러나, 만성 간염 환자에서, HBV 반응성 T 세포는 수시로 삭제됩니다, 역기능, 또는 소모된4,5,6. 따라서, 지속적인 HBV 감염을 가진 개인에서, 항 바이러스 요법, 면역 조절 사이토 카인, 또는 치료 예방 접종을 통해 HBV 특이적 면역 (즉, T 세포 기반 면역)을 회복하려는 시도는 성공하지 못했습니다.
HBV Ag 특이적 T 세포의 입양 세포 전달(ACT)은 결국 남은 간세포 wih HBV7,8을박멸하도록 지시된 효율적인 치료법이다. HBV 감염 마우스내의 HBV 특이적 CTLs의 ACT는 간세포에서 과도, 경증 간염 및 HBV 리보핵산(RNA) 전사체의 극적인 하락을 유발하는 것으로 나타났다. 이러한 연구에서 CTL은 HBV 유전자의 전사를 억제하지 는 않았지만 HBV 전사체9의분해를 향상시켰습니다. HBV 특이적 CTL은 바이러스 감염을 방지하고 HBV10,11의클리어런스를 중재하는 데 중요합니다. ACT 기반 요법의 경우, 생체 내 재정착을 위한 높은 반응성을 가진 HBV 특이적 T 세포의 시험관 내 확장은 이상적인 방법12,13,14; 그럼에도 불구하고, 현재의 접근법은 잠재적인 치료를 위해 환자에게서 HBV 특이적 T 세포의 적절한 수량 및 자질을 생성, 분리 및 성장시키는 능력에 관하여 제한됩니다.
임상 시험은 HBV 바이러스 감염 간세포에 특정엔지니어링 T 세포를 통해 세포 기반 치료의 안전성, 실용성 및 장래 치료 활성을 제시하지만, 불리한 효과에 대한 걱정이 있습니다. T 세포 수용체(TCR)15,16,비특이적 TCR17 및 키메라 Ag 수용체에 의한 오프-타겟 오프 독성에 의한 교차 반응성으로 인해 자가면역 반응에서 발생(CAR) 18세 , 건강한 조직19개. 현재, 생체 내에서 단기 지속성만을 가지는 유전자 변형 T 세포는 일반적으로 중간 또는 이후의 이펙터 T 세포이다. 현재까지 다능성 줄기세포(PSC)는 순진한 단일형 Ag-특이적T세포(20,21,22,23)의높은 숫자를 생성할 수 있는 유일한 공급원이다. 유도된 PSCs (iPSCs)는 몇몇 전사 인자의 유전자 전달의 사용을 통해 환자의 체세포에서 단순히 변환됩니다. 그 결과, iPSCs는 배아 줄기 세포(ESCs)24와유사한 특성을 갖는다. 자기 갱신하는 무한한 능력에 대한 유연성과 가능성으로 인해, 조직 교체 이외에, iPSC 기반 치료는 재생 의학에서 널리 적용될 수 있다. 게다가, 근본적인 iPSCs연대는 현재 세포 기지를 둔 치료를 실질적으로 향상할 수 있습니다.
이 방법의 전반적인 목표는 ACT 기반 면역 요법을 위한 iPSC(즉, iPSC-CTL)로부터 다량의 HBV 특이적 CTL을 생성하는 것이다. 대체 기술에 비해 장점은 HBV 특이적 iPSC-CTL이 단일 유형 TCR 및 순진한 표현형을 가지고 있다는 것입니다. HBV 특이적 iPSC-CTL의 ACT는 간에서 기능성CD8+ T 세포의 이동을 증가시키고 투여된 마우스의 간 및 혈액 모두에서 HBV 복제를 감소시킨다는 것이 입증되었다. 이 방법은 HBV 면역 요법을 위한 바이러스 Ag 특이적 iPSC-CTL의 잠재적사용을 밝히고 바이러스 면역요법을 위한 다른 바이러스 성 Ag 특이적 iPSC-T 세포를 생성하도록 적응될 수 있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜은 뮤린 모델에서 HBV 복제를 억제하기 위해 ACT로서 사용하기 위한 바이러스 성 Ag 특이적 iPSC-CTL을 생성하는 방법을 제시한다. 만성 HBV 감염에서, 바이러스 게놈은 간세포의 수명 내내 지속될 수 있는 안정적인 미니 염색체, 공유 폐쇄된 원형 DNA(cccDNA)를 형성한다. 바이러스성 미니 염색체의 정리를 표적으로 하는 것은 만성 HBV 감염의 치료 귀착될 수 있습니다. 현재 항바이러스 요법은 ?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 HBs183-91 (s183)에 대한 cDNA를 제공하는 토론토 종합 병원 연구소에서 박사 아담 J Gehring 감사 (FLLTRILTI)- 특정 A2 제한 인간 – 뮤린 하이브리드 TCR 유전자, 및 제공에 대한 국립 대만 대학에서 박사 페이 – 저 첸 pAAV/HBV 1.2 구문. 이 작품은 J. S에 건강 보조금 R01AI12180, R01CA221867 및 R21AI109239의 국립 연구소에 의해 지원됩니다.
Materials
| HHD mice | Institut Pasteur, Paris, France | H-2 class I knockout, HLA-A2.1-transgenic (HHD) mice | |
| iPS-MEF-Ng-20D-17 | RIKEN Cell Bank | APS0001 | |
| SNL76/7 | ATCC | SCRC-1049 | |
| OP9 | ATCC | CRL-2749 | |
| pAAV/HBV1.2 plasmid | Dr. Dr. Pei-Jer Chen (National Taiwan University Hospital, Taiwan) | HBV DNA construct | |
| HBs183-91(s183) (FLLTRILTI)-specific TCR genes | Dr. Adam J Gehring (Toronto General Hospital Research Institute, Toronto, Canada) | FLLTRILTI-specific A2-restricted human-murine hybrid TCR genes (Vα34 and Vβ28) | |
| OVA257–264-specific TCR genes | Dr. Dario A. Vignali (University of Pittsburgh, PA) | SIINFEKL-specific H-2Kb-restricted TCR genes | |
| Anti-CD3 (17A2) antibody | Biolegend | 100236 | |
| Anti-CD44 (IM7) antibody | BD Pharmingen | 103012 | |
| Anti-CD4 (GK1.5) antibody | Biolegend | 100408 | |
| Anti-CD8 (53-6.7) antibody | Biolegend | 100732 | |
| Anti-IFN-γ (XMG1.2) antibody | Biolegend | 505810 | |
| Anti-TNF-a (MP6-XT22) antibody | Biolegend | 506306 | |
| α-MEM | Invitrogen | A10490-01 | |
| Anti-HBs antibody | Thermo Fisher | MA5-13059 | |
| ACK Lysis buffer | Lonza | 10-548E | |
| Brefeldin A | Sigma | B7651 | |
| DMEM | Invitrogen | ABCD1234 | |
| FBS | Hyclone | SH3007.01 | |
| FACSAria Fusion cell sorter | BD | 656700 | |
| Gelatin | MilliporeSigma | G9391 | |
| GeneJammer | Agilent | 204130 | |
| HLA-A201-HBs183-91-PE pentamer | Proimmune | F027-4A – 27 | |
| HRP Anti-Mouse Secondary Antibody | Invitrogen | A27025 | |
| mFlt-3L | Peprotech | 250-31L | |
| mIL-7 | Peprotech | 217-17 | |
| Nuclease S7 | Roche | 10107921001 | |
| Paraformaldehyde | MilliporeSigma | P6148-500G | Caution: Allergenic, Carcenogenic, Toxic |
| Permeabilization buffer | Biolegend | 421002 | |
| Polybrene | MilliporeSigma | 107689 | |
| ProLong™ Gold Antifade Mountant with DAPI | Invitrogen | P36931 | |
| QIAamp MinElute Virus Spin Kit | Qiagen | 57704 |
Referencias
- Scaglione, S. J., Lok, A. S. Effectiveness of hepatitis B treatment in clinical practice. Gastroenterology. 142 (6), 1360-1368 (2012).
- Osiowy, C. From infancy and beyond… ensuring a lifetime of hepatitis B virus (HBV) vaccine-induced immunity. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 14 (8), 2093-2097 (2018).
- Gish, R. G., et al. Loss of HBsAg antigen during treatment with entecavir or lamivudine in nucleoside-naive HBeAg-positive patients with chronic hepatitis B. Journal of Viral Hepatitis. 17 (1), 16-22 (2010).
- Kurktschiev, P. D., et al. Dysfunctional CD8+ T cells in hepatitis B and C are characterized by a lack of antigen-specific T-bet induction. Journal of Experimental Medicine. 211 (10), 2047-2059 (2014).
- Fisicaro, P., et al. Antiviral intrahepatic T-cell responses can be restored by blocking programmed death-1 pathway in chronic hepatitis B. Gastroenterology. 138 (2), 682-693 (2010).
- Schurich, A., et al. The third signal cytokine IL-12 rescues the anti-viral function of exhausted HBV-specific CD8 T cells. PLoS Pathogens. 9 (3), 1003208 (2013).
- Gehring, A. J., et al. Engineering virus-specific T cells that target HBV infected hepatocytes and hepatocellular carcinoma cell lines. Journal of Hepatology. 55 (1), 103-110 (2011).
- Xia, Y., et al. Interferon-gamma and Tumor Necrosis Factor-alpha Produced by T Cells Reduce the HBV Persistence Form, cccDNA, Without Cytolysis. Gastroenterology. 150 (1), 194-205 (2016).
- Huang, L. R., Wu, H. L., Chen, P. J., Chen, D. S. An immunocompetent mouse model for the tolerance of human chronic hepatitis B virus infection. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 103 (47), 17862-17867 (2006).
- Wong, P., Pamer, E. G. CD8 T cell responses to infectious pathogens. Annual Review of Immunology. 21, 29-70 (2003).
- Murray, J. M., Wieland, S. F., Purcell, R. H., Chisari, F. V. Dynamics of hepatitis B virus clearance in chimpanzees. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 102 (49), 17780-17785 (2005).
- Hinrichs, C. S., et al. Adoptively transferred effector cells derived from naive rather than central memory CD8+ T cells mediate superior antitumor immunity. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 106 (41), 17469-17474 (2009).
- Hinrichs, C. S., et al. Human effector CD8+ T cells derived from naive rather than memory subsets possess superior traits for adoptive immunotherapy. Blood. 117 (3), 808-814 (2011).
- Kerkar, S. P., et al. Genetic engineering of murine CD8+ and CD4+ T cells for preclinical adoptive immunotherapy studies. Journal of Immunotherapy. 34 (4), 343-352 (2011).
- Kuball, J., et al. Facilitating matched pairing and expression of TCR chains introduced into human T cells. Blood. 109 (6), 2331-2338 (2007).
- van Loenen, M. M., et al. Mixed T cell receptor dimers harbor potentially harmful neoreactivity. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 107 (24), 10972-10977 (2010).
- Cameron, B. J., et al. Identification of a Titin-derived HLA-A1-presented peptide as a cross-reactive target for engineered MAGE A3-directed T cells. Science Translational Medicine. 5 (197), (2013).
- Fedorov, V. D., Themeli, M., Sadelain, M. PD-1- and CTLA-4-based inhibitory chimeric antigen receptors (iCARs) divert off-target immunotherapy responses. Science Translational Medicine. 5 (215), (2013).
- Maus, M. V., et al. T cells expressing chimeric antigen receptors can cause anaphylaxis in humans. Cancer Immunolology Research. 1 (1), 26-31 (2013).
- Haque, R., et al. Programming of regulatory T cells from pluripotent stem cells and prevention of autoimmunity. Journal of Immunology. 189 (3), 1228-1236 (2012).
- Vizcardo, R., et al. Regeneration of human tumor antigen-specific T cells from iPSCs derived from mature CD8(+) T cells. Cell Stem Cell. 12 (1), 31-36 (2013).
- Nishimura, T., et al. Generation of rejuvenated antigen-specific T cells by reprogramming to pluripotency and redifferentiation. Cell Stem Cell. 12 (1), 114-126 (2013).
- Lei, F., et al. In vivo programming of tumor antigen-specific T lymphocytes from pluripotent stem cells to promote cancer immunosurveillance. Investigación sobre el cáncer. 71 (14), 4742-4747 (2011).
- Kim, J. B., et al. Oct4-induced pluripotency in adult neural stem cells. Cell. 136 (3), 411-419 (2009).
- Lei, F., Haque, R., Xiong, X., Song, J. Directed differentiation of induced pluripotent stem cells towards T lymphocytes. Journal of Visualized Experiments. (63), e3986 (2012).
- Lei, F., Haque, M., Sandhu, P., Ravi, S., Ni, Y., Zheng, S., Fang, D., Jia, H., Yang, J. M., Song, J. Development and characterization of naive single-type tumor antigen-specific CD8+ T lymphocytes from murine pluripotent stem cells. OncoImmunology. 6, (2017).
- Haque, M., et al. Melanoma Immunotherapy in Mice Using Genetically Engineered Pluripotent Stem Cells. Cell Transplantation. 25 (5), 811-827 (2016).
- Tan, A. T., et al. Use of Expression Profiles of HBV DNA Integrated Into Genomes of Hepatocellular Carcinoma Cells to Select T Cells for Immunotherapy. Gastroenterology. , (2019).
- Wu, L. L., et al. Ly6C(+) Monocytes and Kupffer Cells Orchestrate Liver Immune Responses Against Hepatitis B Virus in Mice. Hepatology. , (2019).
- Haque, M., et al. Stem cell-derived tissue-associated regulatory T cells suppress the activity of pathogenic cells in autoimmune diabetes. Journal of Clinical Investigation Insights. , (2019).
- Chisari, F. V., et al. Structural and pathological effects of synthesis of hepatitis B virus large envelope polypeptide in transgenic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 84 (19), 6909-6913 (1987).
- Wirth, S., Guidotti, L. G., Ando, K., Schlicht, H. J., Chisari, F. V. Breaking tolerance leads to autoantibody production but not autoimmune liver disease in hepatitis B virus envelope transgenic mice. Journal of Immunology. 154 (5), 2504-2515 (1995).
