Biomeccanica edonteliale perturbatrice tramite Connexin 43 Disgregazione strutturale

Il campo che si riferisce allo studio degli effetti delle forze fisiche e delle proprietà meccaniche sulla fisiologia e patologia cellulare e tissutale è noto come meccanobiologia¹. Alcune tecniche utili che sono state utilizzate nella meccanobiologia sono la microscopia a stress monostrato e la microscopia a forza di trazione. La microscopia a forza di trazione consente il calcolo delle trazioni generate nell’interfaccia del substrato cellulare, mentre la microscopia a sollecitazione del monostrato consente il calcolo delle sollecitazioni intercellulari generate tra celle adiacenti all’interno di un monostrato^{2 ,3,4,5,6}. I risultati ottenuti dai metodi precedenti hanno suggerito che le sollecitazioni meccaniche derivate dalle cellule svolgono un ruolo cruciale nel determinare il destino di una serie di processi cellulari^3,4,5. Ad esempio, dopo l’esposizione a una forza meccanica esterna, un gruppo di cellule che migrano collettivamente può alterare la loro morfologia e polarizzare la loro forma per allineare e migrare lungo la direzione della forza applicata, in parte, generando trazioni^{7, 8}. Le trazioni forniscono una metrica che può essere utilizzata per valutare la contrattilità delle celle e vengono calcolate utilizzando la microscopia della forza di trazione (TFM). La microscopia della forza di trazione (TFM) inizia con la determinazione delle deformazioni del substrato indotte dalle cellule seguita dal calcolo del campo di trazione utilizzando un approccio computazionale matematicamente rigoroso e basato sulla meccanica. Dal momento che la capacità di calcolare le trazioni è stata intorno per un bel po ‘di tempo, i ricercatori hanno utilizzato TFM per rivelare l’impatto che le trazioni hanno su una serie di processi, tra cui il cancro⁹, guarigione della ferita¹⁰ e valutazione del cardiaco ingegnerizzato tessuto¹¹.

L’implementazione di TFM e MSM insieme può essere suddivisa in tre fasi essenziali che devono essere eseguite nel seguente ordine: in primo luogo, vengono determinate le deformazioni dell’idrogel prodotte dalle cellule; in secondo luogo, le trazioni vengono recuperate dalle deformazioni degli idrogel; e terzo, un approccio a elemento finito viene utilizzato per calcolare le sollecitazioni intercellulari normali e di taglio all’interno dell’intero monostrato. Per calcolare gli spostamenti di gel, le immagini di perline di fluorescenza con le cellule sono state confrontate con l’immagine di perline di riferimento (senza cellule) utilizzando una routine di velocitàmetria dell’immagine di particella (PIV) scritta su misura. Le dimensioni e la sovrapposizione della finestra di correlazione incrociata per l’analisi PIV sono state scelte rispettivamente per 32 x 32 pixel e 0,5. A questo punto, gli spostamenti dei pixel sono stati convertiti in micron moltiplicandosi con un fattore di conversione da pixel a micron (per il nostro microscopio, questo fattore di conversione è 0,65) per ottenere spostamenti in piano. Gli errori associati all’ignorare gli spostamenti fuori piano sono trascurabili^12,13. Dopo il calcolo degli spostamenti in gel, ci sono due tipi di misurazioni di trazione che possono essere utilizzate, trazioni vincolate e trazioni non vincolate^8,14. Le trazioni non vincolate forniscono il campo di trazione per l’intero campo visivo (comprese le regioni con e senza celle), mentre le trazioni vincolate forniscono il campo di trazione solo per le regioni che includono le celle¹⁴. Quindi, le sollecitazioni intercellulari vengono calcolate utilizzando la microscopia a stress monomero (MSM), che è un’estensione della microscopia a forza di trazione. L’attuazione di MSM si basa sull’assunto che le trazioni locali esercitate da un monostrato di cellule nell’interfaccia cellulare-substrato devono essere bilanciate da forze meccaniche trasmesse tra le cellule all’interfaccia cellulare, come richiesto dalle leggi di Newton^{7 ,12,13}. Un presupposto chiave qui è che il monostrato cellulare può essere trattato come un foglio elastico sottile perché la distribuzione di trazione nel monostrato è nota e l’equilibrio di forza non dipende dalle proprietà del materiale cellulare. Un’altra ipotesi chiave è che le forze di trazione sono bilanciate da sollecitazioni intercellulari locali all’interno del campo visivo ottico (all’interno del monostrato) e l’influenza di questo equilibrio di forza è minima nella regione distale (al di fuori del monostrato)¹³. Pertanto, le condizioni di contorno definite da sollecitazioni intercellulari, spostamenti o una combinazione di entrambi al limite del monostrato sono cruciali per eseguire MSM¹³. Tenendo conto delle informazioni di cui sopra, utilizziamo MSM per eseguire un’analisi degli elementi finiti (FEM) per recuperare la sollecitazione massima principale_(-max) e la sollecitazione principale minima_(zmin)ruotando il piano di sollecitazione in ogni punto all’interno del Monostrato. Queste sollecitazioni principali vengono successivamente utilizzate per calcolare la media 2Ddella normale sollecitazione intercellulare [(((max ^12,13. Questa procedura è descritta in dettaglio da Tambe et^al.

La microscopia a stress monostrato (MSM) consente il calcolo delle sollecitazioni intercellulari cellulari generate all’interno di un monostrato^6,7,8,12,13. Questi stress intercellulari sono stati suggeriti per essere importanti per la crescita e la riparazione dei tessuti, la guarigione delle ferite e la metastasi del cancro^12,15,16,17. Inoltre, le sollecitazioni intercellulari sono state suggerite per essere importanti anche nella migrazione delle cellule endoteliali e nella funzione di barriera endoteliale^17,18. Mentre le giunzioni cellulari-cellule come giunzioni strette e giunzioni di adesione sono state entrambe suggerite per svolgere un ruolo critico nella generazione e trasmissione della sollecitazione intercellulare endoteliale, il ruolo delle giunzioni gap rimane sfuggente. Le giunzioni gap collegano fisicamente celle adiacenti e forniscono un percorso per la corrente elettrica e le molecole (<1 KDa) per passare tra le celle vicine^19,20,21. Sebbene le cellule endoteliali esprimano le giunzioni gap Cx37, Cx40 e Cx43^19,22, Cx43 è probabilmente la più importante in termini di progressione della malattia²³. Prova dell’importanza di Cx43 può essere trovato nel fatto che la delezione genetica di Cx43 nei topi si traduce in ipotensione²⁴ e ha effetti negativi sull’angiogenesi²⁵. Inoltre, Cx43 è stato documentato per essere importante per la migrazione cellulare e la proliferazione e nella progressione dell’aterosclerosi^{18,22,23,24,25} .

In questo protocollo, abbiamo usato TFM e MSM per studiare se la generazione di trazione e stress intercellulare all’interno del monostrato confluente e endoteliale sarebbe stata influenzata dall’interruzione della giunzione del gap endoteliale Cx43. Abbiamo interrotto Cx43 con 2,5-dihydroxychalcone (chalcone), una molecola documentata per inibire l’espressione Cx43²⁶. Chalcone è stato usato per interrompere cx43 invece di siRNA come chalcone è stato segnalato in precedenza da Lee et al. per interrompere l’espressione Cx43²⁶. Inoltre, eravamo particolarmente interessati all’influenza di chalcone sull’endotelio in quanto è stato anche segnalato per essere un composto anti-infiammatorio e anti-platelet che può essere potenzialmente utilizzato per la prevenzione e il trattamento di vari vascolari patologie²⁶. I trattamenti Chalcone sono stati eseguiti un’ora dopo l’inizio dell’esperimento, i monostrati trattati con chalcone sono stati immagini per un totale di sei ore e l’elaborazione delle immagini è stata eseguita con un codice MATLAB scritto su misura per determinare le trazioni e successivamente intercellulare Sottolinea. I nostri risultati hanno mostrato una diminuzione complessiva delle trazioni e delle sollecitazioni intercellulari, suggerendo che il Cx43 gioca un ruolo chiave nella biomeccanica endoteliale.