코넥신 43 구조적 파괴를 통한 내피 생체역학 의 교란

물리적 인 힘의 효과및 세포 및 조직 생리학 및 병리학에 대한 기계적 특성의 연구를 참조하는 분야는 기계생물학^1로알려져 있다. 메카노생물학에서 활용된 몇 가지 유용한 기술은 단층 스트레스 현미경 검사법 및 견인력 현미경입니다. 견인력 현미경법은 세포 기판 인터페이스에서 생성된 견인력을 계산할 수 있게 해주며, 단층 응력 현미경은 단일층 내의 인접 세포 간에 생성된 세포간 응력의 계산을 허용합니다^{2 ,3},^4,5,6. 이전 방법에서 산출된 결과는 세포 유래 기계적 응력이 세포 프로세스의 호스트의 운명을 결정하는 중요한 역할을 한다는 것을^{건의했습니다 3,4,5.} 예를 들어, 외부 기계적 힘에 노출되면 집단으로 이동하는 셀 그룹이 형태를 변경하고 모양을 편광하여 적용된 힘의 방향을 따라 정렬하고 이동하여 부분적으로견인7을 생성할 수 있습니다. ⁸. 견인은 세포 수축성을 평가하는 데 사용할 수 있는 메트릭을 제공하며 견인력 현미경 검사법(TFM)을 사용하여 계산됩니다. 견인력 현미경 검사법(TFM)은 세포 유도 기질 변형의 결정으로 시작하여 수학적으로 엄격한 역학 기반 계산 접근법을 사용하여 견인장을 계산합니다. 견인력을 계산하는 능력이 꽤 오랜 시간 동안 주변에 있기 때문에, 연구원은 TFM을 활용하여 암^9,상처 치유¹⁰ 및 엔지니어링 심장 평가를 포함한 다양한 프로세스에 대한 견인력이 미치는 영향을 밝혔습니다. 조직¹¹.

TFM 및 MSM의 구현은 다음과 같은 순서로 실행되어야하는 세 가지 필수 단계로 나눌 수 있습니다 : 첫째, 세포에 의해 생성 된 하이드로 겔 변형이 결정됩니다; 둘째, 견인은 하이드로 겔 변형에서 회수됩니다. 셋째, 유한 요소 접근법은 전체 단층 내에서 정상 및 전단 세포 간 응력을 계산하는 데 사용됩니다. 겔 변위를 계산하기 위해, 세포와 형광 비드 이미지를 맞춤형 입자 이미지 속도계(PIV) 루틴을 사용하여 참조 비드 이미지(셀 제외)와 비교하였다. PIV 분석을 위한 상호 상관 윈도우 크기와 겹치는 것은 각각 32 x 32 픽셀 및 0.5로 선택되었다. 이때, 픽셀 시프트는 평면 변위를 얻기 위해 픽셀 대 미크론 변환 인자(우리의 현미경의 경우, 이 변환 인자는 0.65)와 곱하여 미크론으로 변환되었다. 평면 외 변위를 무시하는 것과 관련된 오류는 무시할 수^{있는 12,13입니다.} 겔 변위를 계산한 후, 활용될 수 있는 두 가지 유형의 견인 측정, 제한된 견인력 및 구속되지 않은 견인력^8,14가있다. 구속되지 않은 트랙션은 전체 시야(셀이 있는 영역 및 셀이 없는 영역 포함)에 대한 트랙션 필드를 제공하며, 제한된 트랙션은 셀^14를포함하는 영역에 대해서만 트랙션 필드를 제공합니다. 그런 다음, 세포간 응력은 견인력 현미경 검사법의 연장인 단층 응력 현미경 검사법(MSM)을 사용하여 계산됩니다. MSM의 구현은 셀 기판 인터페이스에서 세포의 단층이 가하는 국부적 견인력이 뉴턴의 법칙 7에서 요구하는 대로 셀-셀 인터페이스에서 세포 간에 전달되는 기계적 힘에 의해 균형을 이루어야 한다는 가정을 기반으로 합니다^{7. ,12,13}. 여기서 중요한 가정은 단층내의 견인 분포가 알려져 있고 힘 균형이 셀 재료 특성에 의존하지 않기 때문에 셀 단층이 얇은 탄성 시트로 처리 될 수 있다는 것입니다. 또 다른 주요 가정은 견인력이 광학 시야 내의 국소 세포 간 응력(단층 내)에 의해 균형을 이루고 이러한 힘 균형의 영향은 원위 영역(단층 외부)에서 최소화된다는^{것입니다 13.} 따라서 단층 경계에서 세포간 응력, 변위 또는 둘 다의 조합으로 정의된 경계 조건은 MSM^13을수행하는 데 매우 중요합니다. 위의 정보를 고려하여 MSM을 사용하여 유한 요소 분석(FEM)을 수행하여 최대 주 응력(σ_max)및 최소 주 응력(σ_min)을복구하여 단층. 이러한 주 응력은 이후에 전체 단층 내에서 2D 평균 정상 세포간 응력 [(σ_max + σ_min)/2] 및 2D 최대 전단 간 응력 [(σ_max – σ_min)/2]를 계산하는 데 사용됩니다. ^12,13. 이 절차는 Tambe 등^12,13에 의해 더 자세히 설명되어 있습니다.

단층 응력 현미경 검사법 (MSM)은 단층^6,7,8,12,13내에서 생성된 세포 간 응력의 계산을 허용합니다. 이러한 세포간 스트레스는 조직 성장 및 수리, 상처 치유 및 암 전이^{12,15,16,17에}중요한 것으로 제안되었다. 또한, 세포간 스트레스는 내피 세포 이동 및 내피 장벽 기능^{17,18에서도}중요할 것으로 제안되었다. 단단한 접합부 및 접착접선 접합부와 같은 세포 세포 접합부는 둘 다 내피 세포 간 응력 생성 및 전송에 있는 중요한 역할을 하기 위하여 건의되는 동안, 간격 접합의 역할은 애매하게 남아 있습니다. 갭 접합부는 인접 한 세포를 물리적으로 연결하고 인접 세포^19,20,21사이를 통과하는 전류 및 분자 (&1 KDa)에 대한 경로를 제공합니다. 내피 세포는 Cx37, Cx40 및 Cx43 갭 접합부^19,22,Cx43을 발현하지만, Cx43은 틀림없이 질병 진행성^23의측면에서 가장 중요하다. Cx43의 중요성의 증거는 마우스에서 Cx43의 유전 적 결실이 저혈압^24의 결과이며 혈관 신생^25에부작용이 있다는 사실에서 발견 될 수 있습니다. 또한, Cx43은 세포 이동 및 증식및 죽상동맥경화증의 진행에 중요한 것으로 문서화되어^{있다 18,22,23,24,25} .

이 프로토콜에서, 우리는 TFM 및 MSM을 사용하여 내피, 내피 단층 내의 견인 및 세포 간 스트레스 생성이 내피 갭 접합 Cx43의 붕괴에 의해 영향을 받을 지 여부를 조사했습니다. 우리는 Cx43 발현^26을억제하기 위해 문서화된 분자인 2,5-디하이드록시찰콘(chalcone)으로 Cx43을 중단시켰습니다. Chalcone은 Cx43 발현^26을중단시키기 위해 이전에 리 외에 의해 보고된 바와 같이 siRNA 대신 Cx43을 중단시키는 데 사용되었다. 또한, 우리는 또한 잠재적으로 다양한 혈관의 예방 및 치료에 사용될 수있는 항 염증 및 항 혈소판 화합물로보고되었기 때문에 내피에 대한 chalcone의 영향에 특히 관심이 있었다 병리학²⁶. Chalcone 처리는 실험 개시 후에 1 시간, chalcone 처리한 단층은 총 6 시간 동안 심상하고, 심상 처리는 견인을 결정하기 위하여 주문을 쓰여진 MATLAB 부호로 수행되고 그 후에 세포 간 스트레스. 우리의 결과는 Cx43이 내피 생체 역학에 있는 중요한 역할을 한다는 것을 건의하는 견인및 세포간 응력에 있는 전반적인 감소를 보여주었습니다.