Mapeo genético de las diferencias de termotolerancia entre especies de levadura Saccharomyces a través del análisis de hemizygosity recíproca en todo el genoma
Summary
La hemizigosidad recíproca a través de la secuenciación (RH-seq) es un nuevo y poderoso método para mapear la base genética de una diferencia de rasgos entre especies. Los grupos de hemizygotes son generados por la mutagénesis de la transposon y su estado físico es rastreado a través del crecimiento competitivo usando la secuenciación alta a lo largo de la secuenciación. El análisis de los datos resultantes identifica los genes subyacentes al rasgo.
Abstract
Un objetivo central de la genética moderna es entender cómo y por qué los organismos en la naturaleza difieren en fenotipo. Hasta la fecha, el campo ha avanzado en gran medida en la fuerza de los métodos de mapeo de vinculación y asociación, que trazan la relación entre las variantes de secuencia de ADN y el fenotipo a través de la progenie recombinante a partir de apareamientos entre individuos de una especie. Estos enfoques, aunque poderosos, no son adecuados para las diferencias de rasgos entre especies aisladas reproductivamente. Aquí describimos un nuevo método para la disección del genoma de la variación del rasgo natural que se puede aplicar fácilmente a especies incompatibles. Nuestra estrategia, RH-seq, es una implementación en todo el genoma de la prueba recíproca de hemizygote. Lo aprovechamos para identificar los genes responsables del sorprendente crecimiento a altas temperaturas de la levadura Saccharomyces cerevisiae en relación con su especie hermana S. paradoxus. RH-seq utiliza mutagénesis transposon para crear un conjunto de hemizygotes recíprocos, que luego se rastrean a través de una competencia de alta temperatura a través de la secuenciación de alto rendimiento. Nuestro flujo de trabajo de RH-seq como se establece aquí proporciona una manera rigurosa e imparcial de diseccionar rasgos antiguos y complejos en el clado de levadura en ciernes, con la advertencia de que se necesita una secuenciación profunda que consume muchos recursos para garantizar la cobertura genómica para la cartografía genética. A medida que los costos de secuenciación disminuyen, este enfoque es muy prometedor para el uso futuro en eucariotas.
Introduction
Desde los albores del campo, ha sido un objetivo primordial en genética entender la base mecanicista de la variación entre individuos salvajes. A medida que mapeamos loci subyacentes a un rasgo de interés, los genes emergentes pueden ser de uso inmediato como dianas para el diagnóstico y los fármacos, y pueden arrojar luz sobre los principios de la evolución. El estándar de la industria hacia este fin es probar una relación entre el genotipo y el fenotipo a través de una población a través de la vinculación o asociación1. Tan poderosos como estos enfoques, tienen una limitación clave: se basan en grandes paneles de progenie recombinante de cruces entre individuos interfértiles. No sirven de nada en el estudio de especies que no pueden aparearse para formar progenie en primer lugar. Como tal, el campo ha tenido poca capacidad para disección imparcial de las diferencias de rasgos entre las especies aisladas reproductivamente2.
En este trabajo informamos de los fundamentos técnicos de un nuevo método, RH-seq3, para estudios a escala del genoma de la base genética de la variación del rasgo entre especies. Este enfoque es una versión masivamente paralela de la prueba recíproca de hemizygote4,5, que fue concebida por primera vez como una manera de evaluar los efectos fenotípicos de las diferencias alélicas entre dos orígenes genéticamente distintos en un locus particular (Figura1A). En este esquema, los dos individuos divergentes se aparean primero para formar un híbrido, la mitad de cuyo genoma proviene de cada uno de los padres respectivos. En este fondo, se generan varias cepas, cada una de las cuales contiene una copia interrumpida o eliminada del alelo de cada uno de los padres del locus. Estas cepas son hemizygous ya que permanecen diploides en todas partes en el genoma excepto en el locus de interés, donde se consideran haploides, y se conocen como recíprocas ya que cada una carece de alelo de un solo padre, con su alelo restante derivado del otro padre. Al comparar los fenotipos de estas cepas recíprocas de hemizigoto, se puede concluir si las variantes de secuencia de ADN en el locus manipulado contribuyen al rasgo de interés, ya que las variantes en el locus son la única diferencia genética entre la recíproca hemizygote cepas. De esta manera, es posible vincular las diferencias genéticas entre las especies con una diferencia fenotípica entre ellas en una configuración experimental bien controlada. Hasta la fecha, las aplicaciones de esta prueba han estado en un marco candidato-gen, es decir, casos en los que la hipótesis ya está en la mano de que la variación natural en un locus candidato podría afectar a un rasgo.
En lo que sigue, establecemos el protocolo para una pantalla de hemizigosidad recíproca a escala del genoma, utilizando la levadura como sistema modelo. Nuestro método crea un complemento genómico de mutantes hemizygote, generando híbridos F1 viables y estériles entre especies y sometiéndolos a mutagénesis de transposión. Agrupamos los hemizygotes, medimos sus fenotipos en ensayos basados en secuenciación y probamos las diferencias de frecuencia entre los clones de la piscina que llevan los alelos de los dos padres de un gen dado. El resultado es un catálogo de loci en el que las variantes entre especies influyen en el rasgo de interés. Implementamos el flujo de trabajo de RH-seq para dilucidar la base genética de las diferencias de termotolerancia entre dos especies de levadura en ciernes, Saccharomyces cerevisiae y S. paradoxus,que divergieron hace 5 millones de años6.
Protocol
Representative Results
Discussion
Las ventajas de RH-seq con los métodos estadístico-genéticos anteriores son varias veces. A diferencia del análisis de vinculación y asociación, RH-seq ofrece una resolución de mapeo monogenético; como tal, probablemente será de utilidad significativa incluso en estudios de variación de rasgos entre individuos de una especie dada, así como diferencias interespecíficas. Además, los intentos anteriores de análisis de hemizigosidad recíproca en todo el genomautilizaron colecciones de m…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a J. Roop, R. Hackley, I. Grigoriev, A. Arkin y J. Skerker por sus contribuciones al estudio original, F. AlZaben, A. Flury, G. Geiselman, J. Hong, J. Kim, M. Maurer, y L. Oltrogge por la asistencia técnica, D. Savage por su generosidad con la microscopía recursos, y B. Blackman, S. Coradetti, A. Flamholz, V. Guacci, D. Koshland, C. Nelson y A. Sasikumar para su discusión; también agradecemos a J. Dueber (Departamento de Bioingeniería, UC Berkeley) por el plásmido PiggyBac. Este trabajo fue apoyado por R01 GM120430-A1 y por Community Sequencing Project 1460 a RBB en el U.S. Department of Energy Joint Genome Institute, un DoE Office of Science User Facility. El trabajo realizado por este último fue apoyado por la Oficina de Ciencia del Departamento de Energía de los Estados Unidos en virtud del Contrato No. DE-AC02-05CH11231.
Materials
| 1-2 plasmid Gigaprep kits | Zymo Research | D4204 | The number of kits required depends on how efficient your preps are in each kit. This kit comes with 5 individual plasmid prep columns. Run 1 L of saturated E. coli culture through each prep column, as using more than 1 L per column can cause clogging of the prep filter, leading to low yield and poor quality DNA. |
| 10X Tris-EDTA (TE) buffer (100 mM Tris-HCl and 10 mM EDTA) | Any | N/A | Filter sterilize through a 0.22 μm filter before use. |
| 1M LiOAc | Any | N/A | Filter sterilize through a 0.22 μm filter before use. |
| 300 mg/mL Geneticin (G418) | Gibco | 11811023 | |
| 52% polyethylene glycol (PEG) 3350 | Sigma | 1546547 | Dissolve in water and filter sterilize through a 0.22 μm filter before use. 1X trafo mix: 228 uL 52% PEG, 36 uL 1M LiOAc, 36 uL 10X TE buffer |
| Autoclaved LB liquid broth | BD Difco | 244620 | Make LB liquid broth using your powder from any brand, and milliQ water. Autoclave it before use. |
| Carbenicillin stock in water (100 mg/mL) | Any | N/A | Filter sterilize through a 0.22 μm filter before use. |
| Complete synthetic agar plates (24.1cm x 24.1cm) with 5-fluoroorotic acid (5-FOA) [0.2% drop-out amino acid mix without uracil or yeast nitrogen base (YNB), 0.005% uracil , 2% D-glucose, 0.67% YNB without amino acids, 0.075% 5-FOA] | 5-FOA: Zymo Research, Drop-out mix: US Biological, Uracil: Sigma, D-glucose: Sigm), YNB: Difco | 5-FOA: F9001-5, Drop-out mix: D9535, Uracil: U0750, D-glucose: G8270, YNB: DF0919 | |
| DMSO | Any | N/A | |
| E. coli strain carrying pJR487 (CEN-/ARS+ piggyBac-containing plasmid) | N/A | N/A | Request from Brem lab. |
| Hybrid yeast strain JR507 (S. cerevisiae DBVPG1373 x S. paradoxus Z1, URA-/URA-) | N/A | N/A | Request from Brem lab. |
| Illumina Hiseq 2500 | used for SE-150 reads | ||
| Large shaking incubators with variable temperature settings | Any | N/A | |
| LB + carbenicillin agar plates (100 μg/mL) | Agar: BD Difco | Agar: 214010 | Make LB agar plates as normal and add carbenicillin to 100 μg/mL before drying. |
| Nanodrop spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-2000 | |
| Qubit Fluorimeter | Thermo Scientific | Q33240 | |
| Salmon sperm DNA | Invitrogen | 15632011 | |
| Water bath at 39°C | Any | N/A | |
| Yeast fungal gDNA prep kit | Zymo Research | D6005 | |
| Yeast peptone dextrose (YPD) liquid media | BD Difco | Peptone: 211677, Yeast Extract: 212750 | Add filter-sterilized D-glucose to 2% after autoclaving. |
| YPD + G418 agar plates (300 μg/mL) | Agar: BD Difco | Agar: 214010 | Make YPD agar plates as normal and add G418 to 300 μg/mL before drying. |
| YPD agar plates | Agar: BD Difco | Agar: 214010 |
Referencias
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