NMR-based Activity Assays for Determining Compound Inhibition, IC₅₀ Values, Artifactual Activity, and Whole-Cell Activity of Nucleoside Ribohydrolases

Die Kernspinresonanzspektroskopie (NMR) ist für die Charakterisierung und Überwachung von Enzymreaktionen^1,2etabliert. Unterschiede in chemischen Verschiebungen und Kopplungsmustern werden verwendet, um Substrat- und Produktresonanzen zu unterscheiden, und relative Resonanzintensitäten werden verwendet, um den Prozentsatz der Reaktion zu quantifizieren. Sowohl der Verbrauch von Substrat als auch die Produktherstellung werden direkt im NMR-Spektrum beobachtet. Dies steht im Gegensatz zur Spektrophotometrie oder Fluoreszenzspektroskopie, bei der der Reaktionszeitverlauf durch eine Änderung der Absorption angezeigt wird, die darauf zurückzuführen ist, dass einige chemische Arten konsumiert oder erzeugt werden. Wie bei den anderen Methoden kann NMR verwendet werden, um Enzymreaktionen in Abhängigkeit von Temperatur, pH oder anderen Lösungsbedingungen zu untersuchen, und die Wirkung von Inhibitoren kann bestimmt werden.

In jüngerer Zeit wurden NMR-basierte Enzymaktivitätstests für das Fragmentscreening^3,4gezeigt. NMR-basierte Assays eignen sich ideal für die Arbeit an den höheren Konzentrationen von Testverbindungen (oft bis zu 1 mM), die zum Nachweis dieser schwächeren Inhibitoren erforderlich sind. Der Dynamikbereich und die chemische Verschiebungsdispersion im NMR-Experiment können Resonanzen von Substrat-, Produkt- und Prüfverbindungen problemlos auflösen. Dies ist im Vergleich zu spektrophotometrischen Assays, bei denen ausgelesene Interferenzprobleme häufig durch Verbindungen mit überlappenden UV-Vis-Absorptionsprofilen entstehen. Da ihnen außerdem Reporterenzyme fehlen, sind die Single-Enzym-NMR-Assays nicht anfällig für gekoppelte Fehlalarme. Dieser Vorteil macht sie nützlich als orthogonale Assays, die traditionelle Hochdurchsatz-Screening-Assays und Tischtriage-Assays⁵ergänzen.

In unserem Forschungslabor werden NMR-basierte Aktivitätstests verwendet, um Inhibitoren von Trichomonas vaginalis Nukleosidribohydrolasen zu identifizieren und zu bewerten. Der T. vaginalis Parasit verursacht die am weitesten verbreitete nicht-virale sexuell übertragbare Krankheit⁶. Die zunehmende Resistenz gegen bestehende Therapien⁷ treibt die Notwendigkeit neuartiger, mechanismusbasierter Behandlungen mit essentiellen Nukleosid-Rettungswegenzymen voran, die Primziele⁸darstellen. NMR-basierte Aktivitätsassays wurden sowohl für Pyrimidin- als auch für Purin-spezifische Enzyme, Uridinnukleosidribohydrolase (UNH)⁹und Adenosin/Guanosin entwickelt, die Nukleosidribohydrolase (AGNH)¹⁰bevorzugen. Die reaktionen, die durch diese beiden Enzyme katalysiert werden, sind in Abbildung 1dargestellt. Die NMR-Assays werden verwendet, um Fragmentbibliotheken auf chemische Ausgangspunkte zu untersuchen,_IC-50-Werte zu bestimmen und aggregationsbasierte oder kovalente Bindungsinhibitoren auszusondern¹¹. Die gleichen Assays werden auch übersetzt, um die Enzymaktivität in ganzen Zellen zu bewerten¹².

Detaillierte Protokolle sind für anfängliche zusammengesetzte Assays bei 500 m und 250 M, Dosis-Wirkungs-Assays zur Bestimmung der IC-50-Werte, Waschmittel-Gegensieb-Assays, Jump-Dilution-Zähler-Screen-Assays und Assays in E. coli-Vollzellen vorgesehen. Die Protokolle sind allgemein auf jedes Enzym anwendbar, in dem Substrat- und Produktresonanzen beobachtet und durch NMR-Spektroskopie unterschieden werden können. Aus Gründen der Einfachheit wurden drei Annahmen getroffen. Erstens ist das Substrat nicht angegeben. Damit NMR-basierte Aktivitätstests nützlich sind, sollte die Endkonzentration des Substrats nicht mehr als das 2-3x des K m-Wertes⁴betragen. In den gezeigten Beispielen liegen die Endkonzentrationen von Adenosin und 5-Fluorouridin bei 100 m (K_m = 54 m) bzw. 50 m (K_m = 15 m). In den Protokollen entspricht die Erreichung dieser Konzentrationen 12 l 5 mM Adenosin oder 12 l mit 2,5 mM 5-Fluorouridin.

Zweitens wurde die in den Protokollen vorgesehene Enzymmenge 5 l so gewählt, dass sie der Menge entspricht, die erforderlich ist, um eine Umwandlung des Substrats in ein Produkt in 30 min zu erreichen. Diese Menge stellt in der Regel eine große Verdünnung aus einem gereinigten Enzymbestand dar, und die Verdünnung muss im Voraus für jedes Enzym bestimmt werden. Gereinigte AGNH- und UNH-Enzym-Lagerlösungen werden bei -80 °C in Aliquots gespeichert, die genügend Enzym für mehrere tausend Reaktionen liefern. Daher muss der Verdünnungsfaktor idealerweise nur alle paar Monate ermittelt oder validiert werden. Drittens ist das spezifische 1D-NMR-Experiment nicht angegeben. In den repräsentativen Ergebnissen wird ¹H NMR für AGNH¹⁰ und ¹⁹F NMR für UNH⁹gezeigt, wobei das NMR-Experiment in den entsprechenden Referenzen beschrieben wird. Die Wahl des NMR-Experiments hängt von der enzymischen Reaktion und den verfügbaren Substraten sowie der verfügbaren NMR-Instrumentierung ab. Schließlich ist darauf hinzuweisen, dass der beschriebene versuchsweise Ansatz nicht den strengen Anforderungen der quantitativen NMR (qNMR)^13,14entspricht. Im Protokoll wird eine prozentuale Reaktion anhand der relativen Intensitätsänderungen der gleichen Resonanz in jedem Spektrum bestimmt, anstatt durch die Bestimmung absoluter Konzentrationen. Dieser Ansatz eliminiert die Notwendigkeit von Änderungen an der Datenerfassung und -verarbeitung sowie für interne oder externe Standards, die für qNMR erforderlich sind.