NMR tabanlı aktivite bileşik Inhibisyonu belirlenmesi için Assays, ıC50 değerleri, Artifactual aktivite, ve Nükrenoside Ribohidolases tüm hücre aktivitesi
Summary
NMR tabanlı aktivite, iki nükle ribohidolaz enzimin inhibitörlerinin tanımlanması ve karakterize edilmesi için geliştirilmiştir. 500 μM ve 250 μM ‘ de ilk bileşik olarak yapılan protokoller, ıC50 değerlerinin belirlenmesi, deterjan sayacı ekranı, atlama-seyreltme sayacı ekranı ve E. coli tüm hücrelerde saptanması için doz-yanıtı sağlar.
Abstract
NMR spektroskopisi, özellikle parça taraması bağlamında ilaç keşfinde enzim inhibitörlerinin tanımlanması ve karakterize edilmesi için kullanılır. NMR tabanlı aktivite, bu zayıf inhibitörleri tespit etmek için gerekli olan test bileşiklerinin daha yüksek konsantrasyonlarda çalışmak için idealdir. NMR deneyinde Dinamik Aralık ve kimyasal vardiya dağılımı, substrat, ürün ve test bileşiklerinin rezonansları kolayca çözebilir. Bu spektrofotometrik analizlerle tezat, hangi okuma-Out parazit sorunları genellikle çakışan UV-Vis emilim profilleri ile bileşiklerin ortaya çıkar. Buna ek olarak, onlar muhabir enzimleri eksikliği beri, tek enzim NMR asdiyor birleşme eğilimli değildir-assay yanlış pozitif. Bu nitelik onları ortogonal olarak yararlı hale getirir, geleneksel yüksek verimlilik taramaları tamamlayan ve en iyi değerlendirme kriterleri tamamlar. 500 μM ve 250 μM ‘ de ilk bileşik bilgi için ayrıntılı protokoller sağlanır, ıC50 değerleri, deterjan sayaç ekranı, atlama-seyreltme sayacı ekranı, ve E. coli tüm hücrelerde de saptanması için doz-yanıtı sağlar. Yöntemler iki nükribohidolaz enzimleri kullanılarak gösterilmiştir. 1H NMR kullanımı purine özgü enzim için gösterilir, 19F NMR pyrimidine özgü enzim için gösterilir iken. Protokoller genellikle substrat ve ürün rezonansları gözlemlenebilir ve NMR spektroskopisi ile ayırt edilen herhangi bir enzim için geçerlidir. İlaç keşfi bağlamında en yararlı olmak için, substrat son konsantrasyonu 2-3x onun Km değeri daha fazla olmalıdır. NMR deneyi seçimi, mevcut NMR enstrümantasyon yanı sıra enzim reaksiyonu ve substratlar bağlıdır.
Introduction
Atom manyetik rezonans (NMR) spektroskopisi, enzim reaksiyonları1,2olarak karakterize etmek ve izlemek için iyi kurulmuştur. Kimyasal vardiya ve kavrama desenleri farklılıkları substrat ve ürün rezonansları ayırt etmek için kullanılır, ve bağıl rezonans yoğunlukları reaksiyon yüzdesini ölçmek için kullanılır. Hem substrat tüketimi hem de ürünün oluşturulması NMR spektrumunda doğrudan görülmektedir. Bu spektrofotometri veya floresans spektroskopisi ile karşıtlık, hangi reaksiyon süresi ders tüketilen veya oluşturulan bazı kimyasal türler için atflama emilebilir bir değişiklik ile belirtilir. Diğer yöntemlerle olduğu gibi, NMR sıcaklık, pH veya diğer çözüm koşullarının bir fonksiyonu olarak enzim reaksiyonları incelemek için kullanılabilir ve inhibitörlerin etkileri tespit edilebilir.
Daha yakın zamanda, NMR tabanlı enzim aktivitesi, parça taraması3,4için gösterildi. NMR tabanlı testler, bu zayıf inhibitörleri tespit etmek için gerekli olan test bileşiklerinin daha yüksek konsantrasyonlarda (genellikle 1 mM kadar yüksek) çalışmak için idealdir. NMR deneyinde Dinamik Aralık ve kimyasal vardiya dağılımı, substrat, ürün ve test bileşiklerinin rezonansları kolayca çözebilir. Bu, Okunma parazitlerinin sıklıkla çakışan UV-Vis emilim profilleriyle bileşiklerden ortaya çıktığı spektrofotometrik analizlere olumlu bir şekilde göre karşılaştırılır. Buna ek olarak, onlar muhabir enzimleri eksikliği beri, tek enzim NMR asdiyor birleşme eğilimli değildir-assay yanlış pozitif. Bu avantaj onları ortogonal olarak yararlı kılar, geleneksel yüksek verimlilik taramaları tamamlayan ve üst düzey kriterlere göre değerlendirme5.
Araştırma laboratuarımızda, NMR tabanlı aktivite teşhis ve Trichomonas vaginalis nükvoyan ribohydrolases inhibitörleri değerlendirmek için kullanılır. T. vaginalis paraziti en yaygın olmayan viral cinsel yolla bulaşan hastalık6neden olur. Mevcut terapilere direnç artırma7 , ana hedefleri temsil eden temel nükle kurtarma yolu enzimleri ile, yeni, mekanizma tabanlı tedaviler için ihtiyaç sürüş olduğunu8. NMR tabanlı aktivite her iki pyrimidine-ve purine özgü enzimler için geliştirilmiştir, üridin nükl tarafı ribohydrolase (Unh)9, ve adenozin/guanozin tercih nükvanoside ribohidolaz (agnh)10. Bu iki enzim tarafından katalizlenmiş reaksiyonlar Şekil 1‘ de gösterilir. NMR asdiyor kimyasal başlangıç noktaları için parça kitaplıkları ekran için kullanılan, ıC50 değerlerini belirlemek, ve ot dışarı toplama tabanlı veya kovalent bağlama inhibitörleri11. Aynı Ayrıca tüm hücrelerde enzim etkinliğini değerlendirmek için tercüme ediliyor12.
500 μM ve 250 μM ‘ de ilk bileşik bilgi için ayrıntılı protokoller sağlanır, ıC50 değerleri, deterjan sayaç ekranı, atlama-seyreltme sayacı ekranı, ve E. coli tüm hücrelerde de saptanması için doz-yanıtı sağlar. Protokoller genellikle substrat ve ürün rezonansları gözlenen ve NMR spektroskopisi tarafından ayırt edilebilir herhangi bir enzim için geçerlidir. Basitlik için üç varsayım yapılmıştır. İlk olarak, substrat belirtilmedi. NMR tabanlı aktivite için yararlı olması için, substrat son konsantrasyonu 2-3x Km değeri4daha fazla olmalıdır. Gösterilen örneklerde, son Adenozin ve 5-fluorouridin konsantrasyonları sırasıyla 100 μM (km = 54 μM) ve 50 μm (km = 15 μm) ‘ dir. Protokollerde, bu konsantrasyonlar elde 12 μL 5 mM adenozin veya 12 μL 2,5 mM 5-fluorouridine karşılık gelir.
Ikinci olarak, protokollerde sağlanan enzim miktarı, 5 μL, yaklaşık% 75 oranında substrat ürüne 30 dakika içinde dönüşmesine neden olmak için gereken miktara karşılık seçildi. Bu miktar genellikle bir arıtılmış enzim stoktaki büyük bir seyreltme temsil eder ve seyreltme her enzim için önceden belirlenmelidir. Saflaştırılmış agnh ve Unh enzim stok çözümleri, birkaç bin reaksiyon için yeterli enzim sağlayan plakaya-80 °c ‘ de saklanır. Böylece, seyreltme faktörü ideal olarak sadece her birkaç ayda bir belirlenmeli veya doğrulanmalıdır. Üçüncü olarak, belirli 1D NMR deneyi belirtilmemiş. Temsili sonuçlarında, 1h NMR agnh10 ve 19F NMR için gösterilen Unh9için gösterilir, NMR deneyi ile ilgili referanslar açıklanmıştır. NMR deneyi seçimi, mevcut NMR enstrümantasyon yanı sıra enzim reaksiyonu ve substratlar bağlıdır. Son olarak, tarif edilen deneysel yaklaşımın nicel NMR (qnmr)13,14‘ ün sıkı gereksinimlerine uymaz olduğunu belirtmelidir. Protokolde, yüzde reaksiyon, mutlak konsantrasyonları belirlemekten ziyade, her spektrumdaki aynı rezonansın yoğunluğunda göreli değişiklikler kullanılarak belirlenir. Bu yaklaşım, qNMR için gerekli olan iç veya dış standartların yanı sıra veri edinme ve işleme değişikliklerinin de gereksinimini ortadan kaldırır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Açıklanan protokoller genellikle birçok enzimler için geçerlidir, substratlar ve/veya ürünlerin NMR spektrumunda çözülebilir sinyaller olması koşuluyla. Ancak, substrat konsantrasyonu Km değerine yakın ve makul bir zaman dilimi içinde bir NMR deneyi tespit edilecek kadar yüksek önemlidir. 2-3x ‘ den yüksek olmayan bir substrat konsantrasyonu, Km değeri rekabetçi, rekabetçi olmayan ve rekabetçi olmayan inhibitörler4‘ ü algılamak için…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz AGNH ve UNH enzimleri sağlamak için AstraZeneca parça Kütüphanesi ve Dr David Parkin bileşikleri sağlayan Dr Dean Brown teşekkür ederiz. Bu yayında bildirilen araştırmalar, Ulusal Sağlık Enstitüsü alerji ve bulaşıcı hastalıklar tarafından R15AI128585 ödül numarası altında, B. J. S. tarafından destekleniyordu. İçerik sadece yazarların sorumluluğundadır ve mutlaka Ulusal Sağlık Enstitüsü ‘nün resmi görüşlerini temsil etmiyor. Research de bir Horace G. McDonell yaz araştırma bursu tarafından destekleniyordu S. N. M., bir Landesberg ailesi ile ödüllendirildi Kardeşlik, Adelphi Üniversitesi ‘nden B. J. S. ‘ ye J. A. G. ve fakülte kalkınma hibe ve Frederick Bettelheim Araştırma Ödülü ‘nü verdi.
Materials
| AGNH | Purified in-house | N/A | TVAG_213720 |
| UNH | Purified in-house | N/A | TVAG_092730 |
| Adenosine | Sigma | A9251 | |
| 5-Fluorouridine | Sigma | F5130 | |
| Dimethyl sulfoxide-D6 | Cambridge Isotope Labs | DLM-10-100 | D, 99.9% |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma | P0662 | |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma | P3786 | |
| Potassium chloride | Sigma | P9541 | |
| Deuterium oxide | Cambridge Isotope Labs | DLM-4-100 | D, 99.9% |
| Hydrochloric acid | Fisher Chemical | A144212 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| 3-(Trimethylsilyl)propionic-2,2,3,3,-d4 acid sodium salt (TSP) | Sigma | 269913 | D, 98% |
| 2,2,2-Trifluoroethanol-1,1-d2 | Sigma | 612197 | D, 99.5% |
| Pipette | Gilson | F123602 | PIPETMAN Classic P1000 |
| Pipette | Gilson | F123601 | PIPETMAN Classic P200 |
| Pipette | Gilson | F123600 | PIPETMAN Classic P20 |
| Microfuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Conical tubes | Corning | 352099 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5418 | |
| Vortex mixer | Fisher Scientific | 02215365 | |
| NMR tubes | Norell | 502-7 | Or as appropriate for the NMR |
| NMR spectrometer | Bruker | N/A | AvanceIII500 |
| Prism software | GraphPad | N/A | Version 5.04 |
Referencias
- Jardetzky, O., Roberts, G. C. K. . NMR in Molecular Biology. , (1981).
- Evans, J. N. S. . Biomolecular NMR spectroscopy. , (1995).
- Dalvit, C., et al. A general NMR method for rapid, efficient, and reliable biochemical screening. Journal of the American Chemical Society. 125, 14620-14625 (2003).
- Dalvit, C. Ligand- and substrate-based 19F NMR screening: Principles and applications to drug discovery. Progress in NMR Spectroscopy. 51, 243-271 (2007).
- Stockman, B. J., et al. Identification of allosteric PIF-pocket ligands for PDK1 using NMR-based fragment screening and 1H-15N TROSY experiments. Chemical Biology & Drug Design. 73, 179-188 (2009).
- Hirt, R. P., Sherrard, J. Trichomonas vaginalis origins, molecular pathobiology and clinical considerations. Current Opinion in Infectious Diseases. 28, 72-79 (2015).
- Conrad, M. D., Bradic, M., Warring, S. D., Gorman, A. W., Carlton, J. M. Getting trichy: Tools and approaches to interrogating Trichomonas vaginalis in a post-genome world. Trends in Parasitology. 29 (2013), 17-25 (2013).
- Versées, W., Steyaert, J. Catalysis by nucleoside hydrolases. Current Opinion in Structural Biology. 13, 731-738 (2003).
- Shea, T. A., et al. Identification of proton-pump inhibitor drugs that inhibit Trichomonas vaginalis uridine nucleoside ribohydrolase. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 24, 1080-1084 (2014).
- Beck, S., Muellers, S. N., Benzie, A. L., Parkin, D. W., Stockman, B. J. Adenosine/guanosine preferring nucleoside ribohydrolase is a distinct, druggable antitrichomonal target. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 25, 5036-5039 (2015).
- Muellers, S. N., et al. Ligand-efficient inhibitors of Trichomonas vaginalis adenosine/guanosine preferring nucleoside ribohydrolase. ACS Infectious Diseases. 5, 345-352 (2019).
- Veronesi, M., et al. Fluorine nuclear magnetic resonance-based assay in living mammalian cells. Analytical Biochemistry. 495, 52-59 (2016).
- Holzgrabe, U. Quantitative NMR spectroscopy in pharmaceutical applications. Progress in NMR Spectroscopy. 57, 229-240 (2010).
- Bharti, S. K., Roy, R. Quantitative 1H NMR spectroscopy. Trends in Analytical Chemistry. 35, 5-26 (2012).
- Dalvit, C., et al. Sensitivity improvement in 19F NMR-based screening experiments: Theoretical considerations and experimental applications. Journal of the American Chemical Society. 127, 13380-13385 (2005).
- Lambruschini, C., et al. Development of fragment-based n-FABS NMR screening applied to the membrane enzyme FAAH. ChemBioChem. 14, 1611-1619 (2013).
- Stockman, B. J. 2-Fluoro-ATP as a versatile tool for 19F NMR-based activity screening. Journal of the American Chemical Society. 130, 5870-5871 (2008).
- Aldrich, C., et al. The ecstasy and agony of assay interference compounds. ACS Central Science. 3, 143-147 (2017).
- Feng, B. Y., Shoichet, B. K. A detergent-based assay for the detection of promiscuous inhibitors. Nature Protocols. 1, 550-553 (2006).
- Copeland, R. A., Basavapathruni, A., Moyer, M., Scott, M. P. Impact of enzyme concentration and residence time on apparent activity recovery in jump dilution analysis. Analytical Biochemistry. , 206-210 (2011).
- Griveta, J. -. P., Delort, A. -. M. NMR for microbiology: In vivo and in situ applications. Progress in NMR Spectroscopy. 54, 1-53 (2009).
- Nijman, S. M. B. Functional genomics to uncover drug mechanism of action. Nature Chemical Biology. 11, 942-948 (2015).
