慢性CDK9抑制的基于小鼠细胞系的模型，研究癌症中普遍存在的非遗传转录伸长缺陷（TE肯定）
Summary
该方案详细介绍了非遗传缺陷转录伸长的体外鼠癌模型。在这里，CDK9的慢性抑制用于抑制RNA Pol II沿亲炎反应基因的生产性伸长，以模仿和研究临床上过度服务的TE绝对现象，存在于大约20%的所有癌症类型中。
Abstract
我们以前曾报道过，癌症的子集是由全球转录性去规则定义的，mRNA转录伸长（TE）中广泛缺乏——我们称这种癌症为TE肯定。值得注意的是，TE绝对癌症的特点是在一组大基因（如干扰素/JAK/STAT 和 TNF/NF-+B 通路）中出现杂散转录和错误 mRNA 处理，导致其抑制。肾细胞癌和转移性黑色素瘤患者肿瘤的TE绝对亚型与免疫治疗反应不良和结果显著相关。鉴于研究TE绝对癌症的重要性——因为它预示着免疫治疗的重大障碍——该协议的目标是建立一个体外TE绝对小鼠模型，以研究这些广泛、非遗传的癌症的转录异常，获得新的见解，现有药物的新用途，或找到对付此类癌症的新策略。我们详细介绍了使用慢性黄酮介导CDK9抑制来废除RNA聚合酶II（RNA Pol II）C端重复域（CTD）上丝氨酸2残留物磷酸化，抑制RNA Pol II释放到生产性转录伸长。鉴于TE绝对癌症没有分类于任何特定的躯体突变，药理学模型是有利的，并且最好模仿在它们中观察到的广泛转录和表观遗传缺陷。使用优化的亚致命剂量的浮华比是创建转录伸长和mRNA处理缺陷的非遗传广泛破坏的可推广模型的唯一有效策略，与临床观察的TE相仿绝对的特点。因此，TE的这个模型绝对可以利用解剖细胞自主因素，使它们能够抵抗免疫介导细胞攻击。
Introduction
几乎所有活性基因表达的一个关键速率限制步骤是RNA聚合酶II（RNA Pol II）从促进子级近端暂停向生产性伸长率1、2的过渡。鉴于转录伸长的表观遗传调节有助于多次人类恶性肿瘤的进展，定义为TE肯定，导致在亲炎反应通路中导致次优信号，相当于一个差的反应免疫疗法3的结果，这个方案的首要目标是建立一个有用的体外模型来研究这些广泛的非遗传转录异常在癌症。因此，使用CDK9的慢性药理抑制是一种有效的策略，用于创建转录伸长和mRNA处理缺陷的非遗传广泛破坏的可推广模型。使用慢性CDK9抑制的原理是，它废除了RNA Pol II的C端重复域（CTD）上丝氨酸2残留物的磷酸化，从而抑制了RNA Pol II释放到生产性转录伸长。此外，TE绝对癌症，以前描述我们组3，没有分类下任何特定的躯体突变。因此，非遗传（药理学）模型是有利的，最好地模仿其中观察到的广泛转录和表观遗传缺陷。本文详细介绍了鼠癌细胞慢性黄体治疗模型的产生和表征。这种方法明显干扰了以长基因组长度为特征的基因的转录伸长，具有稳定启动子和诱导表达，如TNF/NF-B和干扰素/STAT信号，在转录伸长位3，4，5。总体而言，这种可转录伸长缺陷的优化的鼠细胞系模型——我们了解的唯一模型，可以研究新描述的TE绝对肿瘤——驱动抗肿瘤免疫攻击的抵抗力，从而产生一个有用的系统来利用和研究癌症核心转录机制中非遗传缺陷相对于免疫介导细胞攻击的脆弱性。
Protocol
Representative Results
Discussion
RNA Pol II 伸长控制已成为调节刺激反应基因表达的决定性杠杆，有利于恶性细胞5、7、8。克服促进子-近端暂停至伸长和随后的mRNA生产需要P-TEFb9，10，11的激酶活性。我们的模型利用黄酮醇（25 nM），一种必需环素依赖性激酶CDK9的抑制剂，来模拟在TE绝对<…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作部分得到了NCI（CA193549）和CCHMC研究创新试点奖对卡卡扬·科莫罗夫的支持，以及国防部（BC150484）授予纳夫内特·辛格的奖励。内容完全由作者负责，不一定代表国家癌症研究所或国防部的官方观点。资助者在研究设计、数据收集和分析、决定出版或编写手稿方面没有任何作用。
Materials
| hhis6FasL | Cell Signaling | 5452 | |
| 10X TBS | Bio-Rad | 170-6435 | |
| 12 well plates | Falcon | 353043 | |
| 20% methanol | Fisher Chemical | A412-4 | |
| 24-well plates | Falcon | 351147 | |
| 4–18% SDS polyacrylamide gel | Bio-Rad | 4561086 | |
| 4% Paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | AAJ19943K2 | |
| 5% dry milk | Bio-Rad | 170-6404 | |
| 7-Methylguanosine antibody | BioVision | 6655-30T | |
| 96-well plates | Cellstar | 655180 | |
| AF647-conjugated mouse CD8 | Biolegend | 100727 | |
| antibiotic and antimycotic | Gibco | 15240-062 | |
| anti-His antibody | Cell Signaling | 2366 P | |
| Anti-Rabit | Cell Signaling | 7074 | Dilution 1:5000 |
| Anti-Rat | Cell Signaling | 7077S | Dilution 1:5000 |
| Bradford assay Kit | Bio-Rad | 5000121 | |
| BSA | ACROS Organics | 24040-0100 | |
| BV421-conjugated mouse CD45 | Biolegend | 109831 | |
| crystal violet | Sigma | C3886-100G | |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | |
| Dynabeads Oligo (dT)25 | Ambion | 61002 | |
| FBS | Gibco | 45015 | |
| Fixable Live/Dead staining dye e780 | eBioscience | 65-0865-14 | |
| Flavopiridol | Selleckchem | S1230 | |
| H3k36me3 | Abcam | ab9050 | Dilution 1:2000 |
| IFN-α | R&D systems | 12100-1 | |
| IFN-γ | R&D systems | 485-MI-100 | |
| IMDM | Gibco | 12440053 | |
| Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate | Millipore | WBKLS0500 | |
| MojoSort Mouse CD8 T Cell Isolation Kit | Biolegend | 480007 | |
| NF-κB | Cell Signaling | 8242s | Dilution 1:1000 |
| PBS | Gibco | 14190-144 | |
| p-NF-κB | Cell Signaling | 3033s | Dilution 1:1000 |
| p-Ser2-RNAPII | Active Motif | 61083 | Dilution 1:500 |
| p-Ser5-RNAPII | Active Motif | 61085 | Dilution 1:1000 |
| p-STAT1 | Cell Signaling | 7649s | Dilution 1:1000 |
| RiboMinu Eukaryote Kit | Ambion | A10837-08 | |
| RIPA buffer | Santa Cruz Biotechnology | sc-24948 | |
| RNAPII | Active Motif | 61667 | Dilution 1:1000 |
| STAT1 | Cell Signaling | 9175s | Dilution 1:1000 |
| TNF-α | R&D systems | 410-MT-010 | |
| total H3 | Cell Signaling | 4499 | Dilution 1:2000 |
| Tri reagent | Sigma | T9424 | |
| Triton | Sigma | T8787-50ML | |
| Tween 20 | AA Hoefer | 9005-64-5 | |
| β-Actin | Cell Signaling | 12620S | Dilution 1:5000 |
| β-ME | G Biosciences | BC98 |
Referencias
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