Summary

アミロイドフィブリルスによる脳ミトコンドリアの相互作用と膜透過性

Published: September 28, 2019
doi:

Summary

ここで提供されるプロトコルは、異なる組織および脳の様々な領域から分離されたミトコンドリアを有する異なるペプチドおよびタンパク質のネイティブ形態、プレフィブリル、および成熟したアミロイド線維の相互作用を調るためのプロトコルである。

Abstract

ミトコンドリアなどの内部膜を含む膜透過性は、神経変性疾患におけるアミロイド凝集体誘発毒性の一般的な特徴および一次機構であることを示す証拠の増加体。しかし、膜破壊のメカニズムを説明するほとんどの報告はリン脂質モデルシステムに基づいており、生体膜レベルで発生する事象を直接標的とする研究はまれである。ここで説明するアミロイド毒性のメカニズムを膜レベルで研究するためのモデルである。ミトコンドリア単離のために、密度勾配媒体は、最小限のミエリン汚染で調製物を得るために使用されます。ミトコンドリア膜完全性確認後、α-シヌクレイン、ウシインスリン、および鶏卵白リゾザイム(HEWL)から生じるアミロイド線維の相互作用をラット脳ミトコンドリアと、インビトロ生物学的モデルとして調べた。結果は、線維アセンブリを有する脳ミトコンドリアの治療が異なる程度の膜透過性およびROS含有量増強を引き起こす可能性があることを示している。これは、アミロイド線維とミトコンドリア膜との間の構造依存的相互作用を示す。アミロイド線維の生物物理学的特性とミトコンドリア膜への特異的結合は、これらの観察の一部について説明を提供してもよいことが示唆される。

Introduction

アミロイド関連障害は、アミロイドードとして知られており、異なる組織および器官における不溶性タンパク質沈着物の出現によって定義される疾患の大きなグループを構成する1、2。中でも、神経変性疾患は、タンパク質凝集体が中枢または末梢神経系2に現れる最も頻繁な形態である。アミロイド凝集体3の毒性に関与するメカニズムの数が提案されているが、アミロイド病理4の主なメカニズムとして細胞膜破壊および透過性を指摘する証拠の増大するボディは、 5.血漿膜に加えて、内部オルガネラ(すなわち、ミトコンドリア)も影響を受ける可能性があります。

興味深いことに、新しい証拠は、ミトコンドリア機能障害がアルツハイマー病およびパーキンソン病6、7を含む神経変性疾患の病因において重要な役割を果たしていることを示唆している。この問題に関連して、多くの報告は、ミトコンドリア8、9、10にアミロイドβ-ペプチド、α-シヌクレイン、ハンチンチン、およびALS連結変異体SOD1タンパク質の結合と蓄積を示しています。11.アミロイド凝集体による膜透過化のメカニズムは、離散チャネル(細孔)の形成または非特異的洗剤様機構5,12を介して起こると考えられている。 13.これらの結論のほとんどは、リン脂質モデルシステムに関する報告に基づいており、生体膜で起こる事象を直接標的とする研究はまれである。明らかに、これらの人工脂質二重層は、異種構造であり、多種多様なリン脂質およびタンパク質で構成されるミトコンドリアを含む生体膜の本質的特性を必ずしも反映していない。

本研究では、ラット脳から単離されたミトコンドリアをインビトロ生物学的モデルとして用い、α-シヌクレイン(アミロイド原性タンパク質として)、ウシインスリン(モデルペプチドとして)から生じるアミロイド線維の破壊効果を調べる。注射局所的アミロイドーシスに関与するヒトインスリンとの重要な構造相同性、および鶏卵白リソザイム(HEWL;アミロイド凝集の研究のための共通モデルタンパク質として)。アミロイド線維によって誘導されるミトコンドリア膜の相互作用と損傷の可能性は、ミトコンドリアマレートデヒドロゲナーゼ(MDH)(ミトコンドリアマトリックス内に位置する)およびミトコンドリア活性酸素の放出を観察することによって調べられた。種(ROS)の強化。

Protocol

すべての動物実験は、テヘラン大学の医学の機関動物ケアと使用委員会(IACUC)に従って行われました。ギロチンブレードを研ぎ、刃の断固たる迅速な動きを適用することにより、ラットへの苦しみと有害な影響を最小限に抑えるために最大限の努力がなされました。 1. 脳の均質化とミトコンドリア分離 注:ミトコンドリア単離のためのすべての試薬は、…

Representative Results

このプロトコルは、インビトロ生物学的モデルとしてラット脳ミトコンドリアとのアミロイド線維の相互作用を研究するためのモデルを記述する。ミトコンドリア調製に関しては、15%(v/v)密度勾配培地を用いて、脳組織14の主要な汚染としてミエリンを除去した。図1Aに示すように、30,700 x gの遠心分離は、ミエリン(バ…

Discussion

豊富な実験結果は、フィブリル凝集体の細胞毒性が生体膜4、5と相互作用し透過する能力と有意に関連しているという仮説を支持する。しかし、データのほとんどは、リン脂質およびタンパク質の多種多様な異種構造である生体膜の本質的特性を必ずしも反映しない人工脂質二層層に基づいています。ここで、脳ミトコンドリアをインビトロ生体膜…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この研究は、イランのザンジャン基礎科学研究所(IASBS)の助成を受けました。

Materials

2′,7′-Dichlorodihydrofluorescein diacetate Sigma 35845
Ammonium sulfate Merck 1012171000
Black 96-well plate Corning
Black Clear-bottomed 96-well plate Corning
Bovine insulin Sigma I6634
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma A2153
BSA essentially fatty acid-free Sigma A6003
Centrifuge Sigma
Crystal clear sealing tape Corning
CuSO4 Sigma 451657
Dialysis bag (cut off 2 KDa) Sigma D2272
Dounce homogenizer Potter Elvehjem
EDTA Sigma E9884
Fluorescence plate reader BioTek
Fluorescence spectrophotometer Cary Eclipse VARIAN
Folin Merck F9252
Glycine Sigma G7126
Guillotine Made in Iran
HCl Merck H1758
Hen Egg White Lysozyme (HEWL) Sigma L6876
Na2CO3 Sigma S7795
NaH2PO4 Sigma S7907
NaOH Merck S8045
Oxaloacetate Sigma O4126
Percoll GE Healthcare
Phosphate Buffer Saline (PBS) Sigma CS0030
PMSF Sigma P7626
Potassium sodium tartrate Sigma 217255
Quartz cuvette Sigma
Spectrophotometer analytik jena SPEKOL 2000 model
Succinate Sigma S2378
Sucrose Merck 1076871000
Thermomixer Eppendorph
Thioflavin T Sigma T3516
Tris-HCl Merck 1082191000
Triton X-100 Sigma T9284
Tryptone QUELAB
Water bath Memmert
Yeast Extract QUELAB
β-NADH Sigma N8129

Referencias

  1. Merlini, G., Bellotti, V. Molecular mechanisms of amyloidosis. New England Journal of Medicine. 349, 583-596 (2003).
  2. Berg, I. . Modeling amyloid disease in Drosophila melanogaster, Linköping Studies in Science and Technology Dissertation No. 1320. , (2010).
  3. Kagan, B. L., Uversky, V. N., Fink, A. L. Protein aggregation, ion channel formation, and membrane damage. Protein Misfolding, Aggregation, and Conformational Diseases. , 223-236 (2006).
  4. Demuro, A., et al. Calcium dysregulation and membrane disruption as a ubiquitous neurotoxic mechanism of soluble amyloid oligomers. The Journal of Biological Chemistry. 280, 17294-17300 (2005).
  5. Kayed, R., et al. Permeabilization of lipid bilayers is a common conformation-dependent activity of soluble amyloid oligomers in protein misfolding diseases. The Journal of Biological Chemistry. 279, 46363-46366 (2004).
  6. Manczak, M., Park, B. S., Jung, Y., Reddy, P. H. Differential expression of oxidative phosphorylation genes in patients with Alzheimer’s disease: implications for early mitochondrial dysfunction and oxidative damage. Neuromolecular Medicine. 5, 147-162 (2004).
  7. Vila, M., Ramonet, D., Perier, C. Mitochondrial alterations in Parkinson’s disease: new clues. Journal of Neurochemistry. 107, 317-328 (2008).
  8. Petersen, C. A. H., et al. The amyloid β-peptide is imported into mitochondria via the TOM import machinery and localized to mitochondrial cristae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 13145-13150 (2008).
  9. Devi, L., Raghavendran, V., Prabhu, B. M., Avadhani, N. G., Anandatheerthavarada, H. K. Mitochondrial import and accumulation of α-synuclein impair complex I in human dopaminergic neuronal cultures and Parkinson disease brain. The Journal of Biological Chemistry. 283, 9089-9100 (2008).
  10. Costa, V., Scorrano, L. Shaping the role of mitochondria in the pathogenesis of Huntington’s disease. EMBO Journal. 31, 1853-1864 (2012).
  11. Vande Velde, C., Miller, T. M., Cashman, N. R., Cleveland, D. W. Selective association of misfolded ALS-linked mutant SOD1 with the cytoplasmic face of mitochondria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 4022-4027 (2008).
  12. Kagan, B. L., Azimov, R., Azimova, R. Amyloid peptide channels. The Journal of Membrane Biology. 202, 1-10 (2004).
  13. Lashuel, H. A., Hartley, D., Petre, B. M., Walz, T., Lansbury, P. T. Neurodegenerative disease: amyloid pores from pathogenic mutations. Nature. 418, 291 (2002).
  14. Sims, N. R., Anderson, M. F. Isolation of mitochondria from rat brain using Percoll density gradient centrifugation. Nature Protocols. 3, 1228-1239 (2008).
  15. Ghobeh, M., et al. Interaction of Aβ (25-35) Fibrillation Products with Mitochondria: Effect of Small-Molecule Natural Products. Peptide Science. 102, 473-486 (2014).
  16. Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J. Protein measurement with the folin phenol reagent. The Journal of Biological Chemistry. 193, 265-275 (1951).
  17. Sottocasa, G. L., Kuylenstierna, B., Ernester, L., Bergstrand, A. Separation and some enzymatic properties of the inner and outer membrane of rat liver mitochondria. Methods in Enzymology. 10, 448-463 (1967).
  18. Hoyer, W., et al. Dependence of a-Synuclein Aggregate Morphology on Solution Conditions. Journal of Molecular Biology. 322, 383-393 (2002).
  19. Weinreb, P. H., et al. NACP, a protein implicated in Alzheimer’s disease and learning, is natively unfolded. Bioquímica. 35, 13709-13715 (1996).
  20. Porter, R. R. Partition chromatography of insulin and other proteins. The Biochemical Journal. 53, 320-328 (1953).
  21. Goldberg, M. E., Rudolph, R., Jaenicke, R. A kinetic study of the competition between renaturation and aggregation during the refolding of denatured reduced egg white lysozyme. Bioquímica. 30, 2790-2797 (1991).
  22. Young, T. A., Cunningham, C. C., Bailey, S. M. Reactive oxygen species production by the mitochondrial respiratory chain in isolated rat hepatocytes and liver mitochondria: studies using myxothiazol. Archives of Biochemistry and Biophysics. 405, 65-72 (2002).
  23. Meratan, A. A., Ghasemi, A., Nemat-Gorgani, M. Membrane integrity and amyloid cytotoxicity: a model study involving mitochondria and lysozyme fibrillation products. Journal of Molecular Biology. 409, 826-838 (2011).
  24. Katebi, B., Mahdavimehr, M., Meratan, A. A., Ghasemi, A., Nemat-Gorgani, M. Protective effects of silibinin on insulin amyloid fibrillation, cytotoxicity and mitochondrial membrane damage. Archives of Biochemistry and Biophysics. 659, 22-32 (2018).
  25. Fink, A. L. The aggregation and fibrillation of alpha-synuclein. Accounts of Chemical Research. 39, 628-634 (2006).
  26. Diraviyam, K., Stahelin, R. V., Cho, W., Murray, D. Computer modeling of the membrane interaction of FYVE domains. Journal of Molecular Biology. 328, 721-736 (2003).
  27. Van Rooijen, B. D., Claessens, M., Subramaniam, V. Lipid bilayer disruption by oligomeric α-synuclein depends on bilayer charge and accessibility of the hydrophobic core. Biochimica et Biophysica Acta. 1788, 1271-1278 (2009).
  28. Kourie, J. I., Henry, C. L. Ion channel formation and membrane-linked pathologies of misfolded hydrophobic proteins: the role of dangerous unchaperoned molecules. Clinical and Experimental Pharmacology & Physiology. 29, 741-753 (2002).
  29. Bucciantini, M., et al. Inherent toxicity of aggregates implies a common mechanism for protein misfolding diseases. Nature. 416, 507-511 (2002).
  30. Bolognesi, B., et al. ANS binding reveals common features of cytotoxic amyloid species. ACS Chemical Biology. 5, 735-740 (2010).
  31. Posse, E., De Arcuri, B. F., Morero, R. D. Lysozyme interactions with phospholipid vesicles: relationships with fusion and release of aqueous content. Biochimica et Biophysica Acta. 1193, 101-106 (1994).
  32. Roqanian, S., et al. Polyphenols protect mitochondrial membrane against permeabilization induced by HEWL oligomers: possible mechanism of action. International Journal of Biological Macromolecules. 103, 709-720 (2017).
  33. Ulmer, T. S., Bax, A., Cole, N. B., Nussbaum, R. L. Structure and dynamics of micelle-bound human alphasynuclein. The Journal of Biological Chemistry. 280, 9595-9603 (2005).
  34. Stockl, M., Fischer, P., Wanker, E., Herrmann, A. Alpha-synuclein selectively binds to anionic phospholipids embedded in liquid-disordered domains. Journal of Molecular Biology. 375, 1394-1404 (2008).
  35. Devi, L., et al. Mitochondrial import and accumulation of α-synuclein impair complex I in human dopaminergic neuronal cultures and Parkinson disease brain. The Journal of Biological Chemistry. 283, 9089-9100 (2008).
  36. Ghio, S., Kamp, F., Cauchi, R., Giese, A., Vassallo, N. Interaction of α-synuclein with biomembranes in Parkinson’s disease-role of cardiolipin. Progress in Lipid Research. 61, 73-82 (2016).
  37. Petersen, C. A. H., et al. The amyloid β-peptide is imported into mitochondria via the TOM import machinery and localized to mitochondrial cristae. Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 13145-13150 (2008).
  38. Costa, V., Scorrano, L. Shaping the role of mitochondria in the pathogenesis of Huntington’s disease. EMBO Journal. 31, 1853-1864 (2012).
  39. Vande Velde, C., Miller, T. M., Cashman, N. R., Cleveland, D. W. Selective association of misfolded ALS-linked mutant SOD1 with the cytoplasmic face of mitochondria. Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 4022-4027 (2008).
  40. Oladzad Abbasabadi, A., et al. Disruption of mitochondrial membrane integrity induced by amyloid aggregates arising from variants of SOD1. International Journal of Biological Macromolecules. 61, 212-217 (2013).

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Zadali, R., Ghareghozloo, E. R., Ramezani, M., Hassani, V., Rafiei, Y., Chiyaneh, S. M., Meratan, A. A. Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils. J. Vis. Exp. (151), e59883, doi:10.3791/59883 (2019).

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