Summary

Coltivazione del Marine Pelagic Tunicate Dolioletta gegenbauri (Uljanin 1884) per studi sperimentali

Published: August 09, 2019
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Summary

I Doliolidi, tra cui la specie Dolioletta gegenbauri, sono piccoli zooplancton marina gelatinosi di significato ecologico che si trovano sui sistemi produttivi di scaffale subcontinentale in tutto il mondo. La difficoltà di coltivare questi delicati organismi limita la loro indagine. In questo studio vengono descritti gli approcci di coltivazione per la raccolta, l’allevamento e la manutenzione del doliolide Dolioletta gegenbauri.

Abstract

Gli zooplancton gelatinosi svolgono un ruolo cruciale negli ecosistemi oceanici. Tuttavia, è generalmente difficile studiare la loro fisiologia, crescita, fecondità e interazioni trofiche principalmente a causa di sfide metodologiche, compresa la capacità di colture. Questo è particolarmente vero per il doliolide, Dolioletta gegenbauri. D. gegenbauri si verifica comunemente nei sistemi produttivi di scaffale continentale subtropicale in tutto il mondo, spesso a concentrazioni di fioritura in grado di consumare una grande frazione della produzione primaria giornaliera. In questo studio, descriviamo approcci di coltivazione per la raccolta, l’allevamento e il mantenimento di D. gegenbauri allo scopo di condurre studi di laboratorio. D. gegenbauri e altre specie di doliolid possono essere catturati dal vivo utilizzando obliquamente towed conico 202 m reti a rete da una nave alla deriva. Le colture sono stabilite in modo più affidabile quando le temperature dell’acqua sono al di sotto dei 21 gradi centigradi e sono iniziate da gonozoidi immaturi, fostozoidi in scadenza e grandi infermieri. Le colture possono essere mantenute in vasi di coltura arrotondati su una ruota di plancton che ruota lentamente e sostenuta su una dieta di alghe coltivate nell’acqua di mare naturale per molte generazioni. Oltre alla capacità di stabilire colture di laboratorio di D. gegenbauri, dimostriamo che la condizione di raccolta, la concentrazione di alghe, la temperatura e l’esposizione all’acqua di mare naturalmente condizionata sono tutti fondamentali per la coltura crescita, sopravvivenza e riproduzione di D. gegenbauri.

Introduction

Lo zooplancton rappresenta la più grande biomassa animale dell’oceano, è componenti chiave nelle nate alimentari marine e svolge un ruolo importante nei cicli biogeochimici oceanici1,2. Lo zooplancton, anche se composto da un’enorme diversità di organismi, può essere grossolanamente distinto in due categorie: gelatinose e non gelatinose con pochi taxa intermedi3,4. Rispetto allo zooplancton non gelatinoso, lo zooplancton gelatinoso è particolarmente difficile da studiare a causa delle loro complesse storie di vita5e i loro tessuti delicati sono facilmente danneggiati durante la cattura e la manipolazione. Le specie di zooplancton gelatinose sono, quindi, notoriamente difficili da coltura in laboratorio e generalmente meno studiate rispetto alle specie non gelatinose6.

Tra i gruppi di zooplancton gelatinosi, uno abbondante e di importanza ecologica nell’oceano del mondo sono i Thaliaceani. I tunicati pelagici sono una classe di tunicati pelagici che includono gli ordini Salpida, Piromida e Doliolida7. I Doliolida, collettivamente chiamati doliolidi, sono piccoli organismi pelagici a forma di barile che possono raggiungere un’elevata abbondanza nelle regioni neritiche produttive degli oceani subtropicali. I Doliolidi sono tra i più abbondanti di tutti i gruppi zooplancton4,8. Come alimentatori di sospensioni, i doliolidi raccolgono particelle di cibo dalla colonna d’acqua creando correnti filtranti e catturandole sulle reti di muco9. Tassonomiamente, i doliolidi sono classificati nel phylum Urochordata10. Ancestrali ai cordati, e oltre al loro significato ecologico come componenti chiave dei sistemi pelagici marini, i taliacei sono importanti per comprendere le origini della storia della vita coloniale10,11 e l’evoluzione dei cordati5,7,10,12,13,14.

La storia della vita dei doliolidi è complessa e contribuisce alla difficoltà di coltivarli e sostenerli durante il loro ciclo di vita. Una rassegna del ciclo di vita e dell’anatomia doliolidi può essere trovata in Godeaux etal. Il ciclo di vita del doliolide, che comporta un’alternanza obbligatoria tra le fasi della storia sessuale e asessuata, è presentato nella Figura 1. Uova e spermatozoi sono prodotti dai gonozoidi ermatodici, l’unica fase solitaria del ciclo di vita. I gonozoidi rilasciano spermatozoi nella colonna d’acqua e le uova vengono fecondate internamente e rilasciate per svilupparsi in larve. Le larve si schiudono e si trasformano in ozooidi che possono raggiungere 1-2 mm. Suming suming conducive environmental conditions and nutrition, oozooids become early nurses within 1-2 days at 20 sC and initiate the colonial stages of the life cycle. Gli oozoidi producono cime sul loro stolone ventrale. Queste gemme lasciano lo stolone e migrano verso il cadoforo dorsale dove si allineano in tre file accoppiate. Le doppie file centrali diventano forozoidi e le due file doppie esterne diventano trofozoidi. Questi ultimi forniscono cibo sia all’infermiera che ai forozoidi16,17. I trofozoidi forniscono all’infermiera la nutrizione quando perde tutti gli organi interni. Con l’aumentare dell’abbondanza di trofozoidi, la dimensione dell’infermiera può raggiungere i 15 mm in laboratorio. Man mano che i forozoidi crescono, ingerino sempre più prede planctoniche e raggiungono 1,5 mm di dimensione prima di essere rilasciati come individui17. Un singolo infermiere può rilasciare > 100 forozoidi durante la sua durata18. Dopo che i forozoidi vengono rilasciati dal cadoforo, continuano a crescere e sono la seconda fase coloniale del ciclo di vita. Una volta raggiunti i 5 mm, ogni forozoide sviluppa un gruppo di gonozoidi sul loro peduncolo ventrale. Questi gonozoidi possono ingerire particelle quando raggiungono 1 mm di lunghezza. Dopo che i gonozoidi hanno raggiunto le dimensioni da 2 a 3 mm vengono rilasciati dal forozoide e diventano l’unica fase solitaria del ciclo di vita. Una volta raggiunti i 6 mm di dimensione, i gonozoidi diventano sessualmente maturi17. I gonozoidi possono raggiungere 9 mm o più di lunghezza. I gonozoidi sono ermafroditici, lo sperma viene rilasciato a intermittenza mentre la fecondazione degli ovuli avviene internamente16,17. Quando il gonozooid è di 6 mm di dimensione, rilascia fino a 6 uova fecondate. Una coltura di successo richiede il sostegno alle esigenze specifiche di ognuna di queste fasi uniche della storia della vita.

A causa del significato ecologico ed evolutivo dei tualiacei, compresi i doliolidi, c’è bisogno delle metodologie di coltivazione per far progredire la comprensione della biologia unica di questo organismo, della fisiologia, dell’ecologia e della storia evolutiva19 . I Doliolidi hanno notevoli promesse come organismi modello sperimentale nella biologia dello sviluppo e nella genomica funzionale perché sono trasparenti e probabilmente hanno genomi semplificati20,21. La mancanza di metodi di coltivazione affidabili, tuttavia, ne ostacola l’utilità come modelli di laboratorio. Anche se una manciata di laboratori hanno pubblicato risultati basati su doliolidi coltivati, per i nostri approcci di coltivazione della conoscenza e protocolli dettagliati non sono stati pubblicati in precedenza. Sulla base di anni di esperienza, e tentativi di prova ed errore di coltivazione, lo scopo di questo studio era quello di rivedere le esperienze e di condividere i protocolli per la raccolta e la coltivazione di doliolidi, in particolare la specie Dolioletta gegenbauri.

Protocol

1. Preparazione impianti di coltura per l’allevamento D. gegenbauri NOTA: tutti i materiali e le attrezzature necessari sono elencati nella Tabella dei materiali. Preparare la soluzione 1 M di idrossido di sodio (NaOH), 0,06M di Potassio Permanganate (KMnO 4). Per preparare questa soluzione, sciogliere 400 g di NaOH in 10 L acqua deionizzata. Aggiungere 100 g di KMnO4 alla soluzione NaOH e mescolare bene. Preparare una soluzio…

Representative Results

Seguendo le procedure descritte per la raccolta e la coltura del doliolide, D. gegenbauri delineato figura 3, è possibile mantenere una cultura di D. gegenbauri per tutta la sua storia di vita complessa (Figura 1) e sostenerlo per molte generazioni. Anche se la coltivazione di D. gegenbauri è descritta qui, queste procedure dovrebbero essere rilevanti anche per la coltivazione di altre specie doliolidi. L’…

Discussion

La capacità di coltura doliolidi è stata stabilita nel corso degli ultimi decenni ed è stata utilizzata per sostenere la ricerca in diversi settori. Studi sperimentali nei nostri laboratori hanno sostenuto la pubblicazione di almeno 15 studi scientifici incentrati sull’alimentazione e la crescita18,26, riproduzione18,28, dieta6, 29, fisiologia…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Siamo grati alle molte persone che hanno contribuito alla conoscenza accumulata a questo progetto nel corso degli anni, tra cui G.-A. Paffenhàfer e D. Deibel che originariamente svilupparono questi protocolli. Anche M. Kàster e L. Lamboley hanno contribuito in modo significativo allo sviluppo di queste procedure.  N.B. L’Pez-Figueroa e l’E.E. Rodriguez-Santiago hanno generato le stime dell’abbondanza di doliolidi fornite nella tabella 1. Questo studio è stato sostenuto in parte dai premi della US National Science Foundation OCE 082599, 1031263 a MEF, progetti collaborativi OCE 1459293 e OCE 14595010 a MEF e DMG e, il premio National Oceanic and Atmospheric Administration NA16SEC4810000 a DMG. Siamo grati all’equipaggio laborioso e professionale della R/V Savannah. Lee Ann DeLeo preparò le figure, Charles Y. Robertson rileviillo del manoscritto e James (Jimmy) Williams produsse la ruota del plancton

Materials

Algal culture tubes (55 mL sterile disposable glass culture tubes) Any NA For algal cultures
Autoclave Any NA For sterilizing equipment and seawater for algal cultures
Beakers (2 L glass) Any NA For sorting diluted plankton net tow contents
Buckets (5 gallon, ~20L) Any NA For diluting contents of planton net tow – should be seawater conditioned before first use
Carboys (20 L)  Any NA For storing seawater
Doliolid glass culturing jar (1.9 L narrow mouth glass jar with cap) Qorpak GLC-01882 Container for culture
Doliolid glass culturing jar (3.8 L narrow mouth glass jar with cap) Qorpak GLC-01858 Container for culture
Environmental Chamber (Temperature controlled enviromental chamber) Any NA To accommodate plankton wheel and culture maintenance
Filtration apparatus for 47 mm filters Any NA For filtering seawater for cultures
Glass microfiber filters, 47 mm Whatman 1825-047 For filtering seawater for cultures
Glass pipette (borosillicate glass pipette (glass tubing), OD 10mm, ID 8 mm, wall thickness 1mm) Science Company NC-10894 Custom cut and edges polished
Hose clamps, stainless steel, #104 (178 mm) Any NA For holding culturing jars to the plankton wheel
Isochrysis galbana strain CCMP1323 National Center for Marine Algae and Microbiota (NCMA) strain CCMP1323 For feeding doliolid cultures
L1 Media Kit, 50 L National Center for Marine Algae and Microbiota (NCMA) MKL150L For culturing algae
Lamp (Fluorescent table lamp with an adjustable arm) Any NA For illuminating doliolids in the jars and beakers
Lighted temperature controlled incubator Any NA For algal cultures
Micropipettes and sterile tips (0-20 µl, 20-200 µl, 200-1000 µl) Any NA For algal cultures
Plankton Net (202 µm 0.5 m, 5:1 length) with cod end ring and  4 L aquarium cod-end Sea-Gear Corporation 90-50×5-200-4A/BB For collecting living doliolids (see Figure 4)
Plankton Wheel NA NA Custom built (see Figure 2)
Plastic wrap Any NA To cover inside of lid of doliolid culture jars
Potassium Permanganate Fisher Scientific P279-500 Reagent for cleaning jars and glassware
Rhodomonas sp. strain CCMP740 National Center for Marine Algae and Microbiota (NCMA) strain CCMP740 For feeding doliolid cultures
Rubber Tubing NA NA For holding culturing jars to the plankton wheel (can be made from tygon tubing)
Sodium Bisulfite Fisher Scientific S654-500 Reagent for cleaning jars and glassware
Sodium Hydroxide Fisher Scientific BP359-212 Reagent for cleaning jars and glassware
Sterile serological pipettes (1 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL) Any NA For algal cultures
Thalassiosira weissflogii strain CCMP1051 National Center for Marine Algae and Microbiota (NCMA) strain CCMP1051 For feeding doliolid cultures
Tissue culture flasks (250 mL) Any NA For algal cultures

Referencias

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Walters, T. L., Gibson, D. M., Frischer, M. E. Cultivation of the Marine Pelagic Tunicate Dolioletta gegenbauri (Uljanin 1884) for Experimental Studies. J. Vis. Exp. (150), e59832, doi:10.3791/59832 (2019).

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