生物层干涉测量(BLI)在转录中研究蛋白质-蛋白质相互作用的应用
Summary
转录因子(TFs)与RNA聚合酶的相互作用通常使用下拉测定进行研究。我们应用生物层干涉测量(BLI)技术来描述GrgA与衣原RNA聚合酶的相互作用。与下拉检测相比,BLI可检测实时关联和解结,具有更高的灵敏度,并且具有高度定量性。
Abstract
转录因子 (TF) 是一种通过与 RNA 聚合酶、另一个 TF 和/或模板 DNA 相互作用来调节基因表达的蛋白质。GrgA是一种新型转录活化剂,专门存在于细胞内细菌病原体衣原体中。使用亲和珠的蛋白质下拉测定表明,GrgA结合两个β因子,即=66和+28,它们识别不同基因的启动子,其产物在发育阶段需要差异。我们使用 BLI 来确认和进一步描述相互作用。BLI 演示了与下拉之间的几个优点:1) 它揭示了绑定伙伴之间的实时关联和解散;2) 它生成定量动力学参数;3) 它可以检测下拉分析经常无法检测到的绑定。这些特征使我们能够推断出GrgA在衣原体基因表达调节中的生理作用,以及可能的详细相互作用机制。我们设想,这种相对负担得起的技术对于研究转录和其他生物过程非常有用。
Introduction
转录,利用DNA作为模板产生RNA分子,是基因表达的第一步。细菌RNA合成开始结合RNA聚合酶(RNAP)霍洛酶到目标启动子1,2。RNAP全酶(RNAPholo)由多亚单位催化核心(RNAPcore)和+因子组成,这是识别启动子序列所必需的。转录活化剂和抑制剂,统称为TF,通过RNAPcore的结合成分、β因子和/或DNA调节基因表达。根据生物体的不同,其基因组的很大一部分可能用于控制转录的TF,以响应生理需要和环境线索3。
衣原体是一种强制性的细胞内细菌,负责人类和动物的多种疾病4、5、6、7、8。例如,衣原体沙眼可以说是全世界人类头号性传播的病原体,也是一些欠发达国家失明的主要原因。衣原体有一个独特的发育周期,其特征是两种交替的细胞形式,称为基本体(EB)和视网膜体(RB)9。然而,HB能够在细胞外环境中生存,但它们不能扩散。EB通过内分泌进入宿主细胞,并在接种后几小时内在宿主细胞质的真空中分化成较大的RB。不再具有传染性,RB 通过二元裂变扩散。大约20小时,他们开始分化回IB,在30-70小时左右退出宿主细胞。
衣原体发育周期的进展由转录调节。近1000个衣原体基因中,绝大多数是在RB积极复制的中周期中表达的,而只有少量基因在IB进入宿主细胞后立即被转录,从而开始转换BB进入RB,另一组小基因被转录或越来越多地转录,使RB分化为BB10,11。
衣原体基因组编码三个+因子,即+66,+28和+54。*66,相当于大肠杆菌和其他细菌的内务管理+70,负责识别早期和中期基因的启动子以及一些晚期基因,而#28和+54是需要的某些晚期基因的转录。已知几个基因同时携带+66依赖启动子和β28依赖启动子12。
尽管发展周期复杂,但在衣原体13中只发现了少量的TF。GrgA(以前在C.沙眼血清D和CTL0766中被批报为假设蛋白CT504,在C.沙眼L2中)是一种衣原体特异性TF,最初被确认为β66依赖基因14的活化剂。亲和力下拉测定表明,GrgA通过结合+66和DNA来激活其转录。有趣的是,后来发现GrgA也与β28共沉淀,并在体外15号激活来自+28依赖启动子的转录。为了研究GrgA在+66和+28中是否有相似或不同的亲和力,我们采用BLI。BLI 测定表明,GrgA 与 +66的亲和力比 ±28高 30 倍,这表明 GrgA 在+66依赖转录和+28依赖转录中可能发挥不同作用15.
BLI检测从生物传感器尖端的固定蛋白层反射的白光的干扰模式,并将其与内部参考层16进行比较。通过分析这两种干扰模式,BLI可以提供有关与生物传感器尖端结合的蛋白质量的宝贵实时信息。固定在生物传感器尖端的蛋白质称为配体,通常借助与相关粒子(如 NTA 或 NTA 或 NTA 或 NTA)相关的聚物或生物素标记(例如,聚物素标记)帮助固定链球菌)在生物传感器的尖端。二次蛋白(称为Anlyate)与生物传感器尖端的配体结合,会改变生物传感器的不集中度,从而导致干扰模式的变化。当在分析剂的不同浓度上重复时,BLI不仅可以提供定性信息,还可以定量地提供有关配体和分析剂16之间的亲和力的信息。
据我们所知,我们率先使用BLI来描述转录15中的蛋白质-蛋白质相互作用。在本出版物中,我们演示了 GrgA 片段(以前显示需要进行 28-绑定)确实调解了绑定。本手稿侧重于 BLI 测定的步骤,以及结合动力学的 BLI 图形和参数的生成。这里不包括配体和分析物的生产(和纯化)方法。
Protocol
Representative Results
Discussion
蛋白质-蛋白质相互作用对于转录和其他生物过程的调节至关重要。它们最常通过下拉检测进行研究。虽然下拉分析相对容易执行,但它们的定量性较差,可能无法检测弱但具有生物学意义的相互作用。相比之下,通过检测配体和解毒物之间的实时关联和解散,BLI 提供关联和解散率常数以及整体亲和力。
与下拉检测相比,BLI测定具有更高的灵敏度。例如,GrgA-+28相互作用通过 B…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了国家卫生研究院(Grants # AI122034 和 AI140167) 和新泽西州健康基金会(Grant = PC 20-18)的支持。
Materials
| BLItz machine | ForteBio | 45-5000 | |
| Dialysis tubing cellulose membrane | MilliporeSigma | D9652 | |
| Dip and Read Ni-NTA biosensor tray | ForteBio | 18-5101 | Ready-to-use Ni-NTA biosensors for poly-His-tagged Proteins |
| Drop holder | ForteBio | 45-5004 | |
| PCR tubes (0.2 mL) | Thomas Scientific | CLS6571 | |
| Microcentrifuge tubes (black) | Thermo Fisher Scientific | 03-391-166 | |
| Kimwipes | Thermo Fisher Scientific | 06-666A | |
| DTT | Thermo Fisher Scientific | R0861 | |
| EDTA | MilliporeSigma | E6758 | |
| MgCl2 | MilliporeSigma | M8266 | |
| NaCl | MilliporeSigma | S9888 | |
| Tris-HCl | GoldBio | T095100 |
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