Her beskriver vi en indirekte ELISA sandwich immunocapture for å bestemme immungen glykoprotein innholdet i rabies vaksiner. Denne testen bruker et nøytraliserende monoklonalt antistoff (mAb-D1) som gjenkjenner glykoproteintrimmere. Det er et alternativ til in vivo NIH-testen for å følge konsistensen av vaksinepotens under produksjonen.
Den økende globale bekymringen for dyrevelferden oppmuntrer produsenter og National Control Laboratories (OMCLs) til å følge 3Rs-strategien for erstatning, reduksjon og raffinement av laboratoriedyrtestingen. Utviklingen av in vitro tilnærminger anbefales på WHO og europeiske nivåer som alternativer til NIH-testen for evaluering av rabies vaksine styrke. Ved overflaten av rabiesviruset (RABV) partikkel utgjør trimmere av glykoprotein det store immunogen for å indusere Viral Neutralizing Antibodies (VNAbs). En ELISA-test, hvor nøytraliserende monoklonale antistoffer (mAb-D1) gjenkjenner den trimeric formen av glykoproteinet, er utviklet for å bestemme innholdet i det innfødte trimericglykoproteinet sammen med produksjonen av vaksinebatchene. Denne in vitro potenstesten viste en god konkordans med NIH-testen og har blitt funnet egnet i samarbeidsstudier av RABV-vaksineprodusenter og OMCLer. Unngåelse av dyrebruk er et oppnåelig mål i nær fremtid.
Metoden som presenteres er basert på en indirekte ELISA sandwich immunocapture ved hjelp av mAb-D1 som gjenkjenner de antigene stedene III (aa 330 til 338) av trimeric RABV glykoprotein, det vil si det genene immun RABV antigen. mAb-D1 brukes til både belegg og påvisning av glykoproteintrimmer ei vaksinebatch. Siden epitopen gjenkjennes på grunn av konformasjonsegenskapene, kan det potensielt denaturert glykoprotein (mindre immunogent) ikke fanges opp og oppdages av mAb-D1. Vaksinen som skal testes inkuberes i en plate sensibilisert med mAb-D1. Bundet trimeric RABV glykoproteiner identifiseres ved å legge til mAb-D1 igjen, merket med peroksidase og deretter avslørt i nærvær av substrat og krom. Sammenligning av absorbansen målt for den testede vaksinen og referansevaksinen gjør det mulig å bestemme det immunogene glykoproteininnholdet.
Siden mer enn 50 år brukes NIH-testen1 som en gullstandardmetode for å evaluere rabiesvaksinens styrke før batchutgivelsen. Denne testen består av en intraperitoneal immunisering av grupper av mus med vaksinen som skal testes etterfulgt av en intra-cerebral (IC) utfordring 14 dager senere med Challenge Virus Standard (CVS) stamme av rabies virus (RABV). Styrken evalueres fra andelen mus som overlever IC-utfordringen. Selv om WHO2 og European Pharmacopeia3 fortsatt krever NIH-testen for å vurdere vaksinens styrke, lider denne testen flere hindringer: resultatene er svært variable4; smittsomme RABV brukes under utfordringen, og dette krever både tekniske ferdigheter og strenge biosikkerhetstiltak; et stort antall dyr brukes, og alvorlighetsgraden av utfordringen reiser alvorlige etiske bekymringer5. En mindre alvorlig variant av denne testen er utviklet: to uker etter intra-peritoneal immunisering, mus er ikke utfordret av IC, men blødde og testet for tilstedeværelse av spesifikke RABV nøytraliserende antistoffer (VNAbs) i deres serum ved hjelp av en in vitro nøytralisering test. Denne testen krever imidlertid fortsatt å ofre et stort antall laboratoriemus, selv om den allerede er i bruk for veterinærvaksinene6,7 og har blitt vurdert for humane vaksiner8.
Per nå oppfordrer både International9 og European10 anbefalinger produsenter og nasjonale kontrolllaboratorier (Official Medicine Control Laboratories – OMCLs) til å implementere erstatning, reduksjon og raffinement av laboratoriedyrtesting, referert til 3Rs strategi. Eu-direktiv 2010/63/EU (gjelder siden 2013/01/01) knyttet til beskyttelse og velferd for dyr har også forsterket begrensningene for vaksineprodusenter og laboratorier som er involvert i kvalitetskontroll av rabiesvaksiner samt i rabiesforskning11. Som et resultat har utvikling, validering og bruk av alternative in vitro tilnærminger nå blitt en prioritet. Dette er ikke bare etisk forsvarlig, men kan også redusere batch testing kostnader og forkorte tiden for resultater til timer i stedet for uker3.
På overflaten av RABV partikkel, glykoprotein vedtar en trimeric form12,13,14,15,16. I rabiesvaksine utgjør denne innfødte trimeric formen den store immunogen indusere VNAbs17 mens monomeriske, oppløselige eller denaturertglykoproteiner er dårlig immungene18,19. Dermed er bevaring av trimmere av glykoproteinet langs vaksineproduksjonsprosessen en god indikator for bevaring av et optimalt immungenpotensial. Flere immunkjemiske metoder, som antistoffbindende test20,21, den enkle radiale immundiffusjonen (SRD) test22 og ELISA-testen23,24,25,26,27 anbefales av WHO Technical Report Series2 og den europeiske monografien3 for å kvantifisere antigeninnholdet i rabiesvaksiner. Disse brukes av produsenter til å overvåke konsistensen av vaksineproduksjon og av OMCL for å vurdere den konsekvente formuleringen av grupper av humane vaksiner28, selv om NIH-testen fortsatt vurderes for styrken.
Alle disse immunkjemiske metodene er imidlertid ikke like. SRD-testen krever en forbehandling som kan endre membranforankret trimmere og resultere i en løselig eller denaturert form av glykoproteinet 22,29. Derfor er SRD ikke mye effektiv i diskriminering mellom immunogene og ikke-immungene glykoproteiner som resulterer i en ufullkommen vurdering av immunogenisiteten til en vaksinetomt. Derimot er ELISA-testen mer følsom22, bevarer den opprinnelige strukturen til glykoproteinet, og er mer hensiktsmessig å bestemme innholdet i de innfødte foldede trimmene av glykoprotein. ELISA-testen kan bruke enten kaninpolyklonale eller musmonoklonale antiglykoproteinantistoffer renset eller konsentrert med ammoniumsulfat. Studier har vist god konkordans mellom NIH-testen og antigeninnholdet evaluert av ELISA i vaksiner og konkludertmed at ELISA-metoder er egnet for in vitro potenstesten. Dette talsmenn som ELISA tester kan minst supplere eller erstatte NIH test4,26,27,30,31,32,33. I dag anbefaler Den europeiske pharmacopoeia bruk av validerte serologiske eller immunokjemiske analyser som alternativer til NIH-testen3. Fullstendig unngåelse av dyrebruk for vaksinestyrke har blitt et realistisk perspektiv.
Metoden nedenfor er basert på en indirekte ELISA sandwich immunocapture ved hjelp av en mus monoklonal antistoff klone (mAb-D1) som gjenkjenner antigene områder III (aa 330 til 338) av trimeric RABV glykoprotein15,34. Denne metoden ble utviklet i utgangspunktet ved Institut Pasteur26,30 deretter optimalisert og validert av Agence Nationale de Sécurité du Médicament et des produits de santé (ANSM) laboratorium, det vil si den franske OMCL4,33. MAb-D1 brukes både til å sensibilisere platen og deretter for å oppdage det fangede antigenet. Dette gjør det mulig for spesifikk kvantifisering av glykoproteintrimmerne, det vil si det immunogene RABV-antigenet. MAb-D1 som brukes til deteksjon er merket med peroksidase, som avsløres i nærvær av substrat et og krom. Sammenligning av absorbansen målt for den testede vaksinen og referansevaksinen gjør det mulig å bestemme det immunogene glykoproteininnholdet. Det er verdt å merke seg at samme type analyse kan brukes for forskjellige mAbs gjenkjenne ulike antigene steder av RABV glykoprotein35. Metoden for å skaffe og rense eller konsentrere seg med ammoniumsulfat anti-glykoprotein polyklonale kaninimmunoglobuliner G (IgG) eller monoklonale museglobuliner har blitt grundig beskrevet tidligere36 sammen med metoden for å konjugere antistoffer med peroxidase37.
Epitopen anerkjent av mAb-D1 ligger i det antigene området III av RABV glykoprotein som ikke bare er immunodominerende for induksjon av VNAbs, men også involvert i nevrovirulens, patogene40,41 og reseptorgjenkjenning42. Det er et annet viktig antigent sted langs glykoprotein, sted II43, mot hvilke flere MAbs har blitt isolert som mAb-WI-111235. Disse kan også brukes i lignende type eksperi…
The authors have nothing to disclose.
Dr. Sylvie Morgeaux og Dr. Jean-Michel Chapsal må anerkjennes for deres viktigste deltakelse for å etablere ELISA-analysen om vaksinegrupper og for å organisere internasjonale workshops og samarbeidsstudier. Vi takker Sabrina Kali for kritisk lesning av manuskriptet. Dr. Pierre Perrin var ansvarlig for isolasjon og karakterisering av mAb-D1. Dette arbeidet har i hovedsak blitt støttet av Institut Pasteur-finansiering.
Class II Biological Safety Cabinet | ThermoFisher Scientific | 10445753 | if titrating live virus |
Clear Flat-Bottom Immuno Nonsterile 96-Well Plates, 400 µL, MAXISORP | ThermoFisher Scientific | 439454 | good for binding to the loaded antibody |
Equip Labo Polypropylene Laboratory Fume Hood | ThermoFisher Scientific | 12576606 | for the preparation of sulfuric acid |
Immunology Plate Strong Adsorption MAXISORP Flat Bottom Well F96 |
Dutscher | 55303 | good for binding to the loaded antibody |
Microplate Sealing Tape(100 sheets) | ThermoFisher Scientific | 15036 | |
Microplate single mode reader Sunrise | TECAN | ||
Microplate shaker-incubator | Dutscher | 441504 | |
Microplate washer Wellwash | ThermoFisher Scientific | 5165000 | |
Multichannel pipette (30-300 µL) 12 channels | ThermoFisher Scientific | 4661180N | |
Single Channel pipettes (Kit 2 : Finnpipettes F2 0.2-2 μL micro, 2-20 μL, 20-200 μL & 100-1000 μL) | ThermoFisher Scientific | 4700880 |