体外ELISA测试评估狂犬病疫苗效力

50多年来，NIH测试¹被用作一种黄金标准方法，在批次发布前评估狂犬病疫苗的功效。该测试包括对带有疫苗的小鼠组进行腹内免疫，然后14天后与狂犬病病毒挑战病毒标准（CVS）菌株（RABV）进行脑内（IC）挑战。从在IC挑战中幸存下来的小鼠比例来评估效力。虽然世卫组织²和欧洲药典³仍然需要NIH测试来评估疫苗的功效，但该测试面临几个障碍：结果高度可变^4;传染性RABV在挑战期间使用，这既需要技术技能和严格的生物安全措施;大量动物被使用，挑战的严重性引起了严重的伦理问题^。这种测试的一个不太严重的变异已经形成：在腹管内免疫两周后，小鼠不受IC的挑战，而是通过体外中和测试，在血清中存在特定的RABV中和抗体（VNAbs）进行流血和测试。然而，这项试验仍然需要牺牲大量的实验鼠，虽然它已经用于兽医疫苗^66，7，7并已考虑为人类疫苗^8。.

截至目前，国际⁹国和欧洲¹⁰项建议都鼓励制造商和国家控制实验室（官方药物控制实验室 -OMCL）实施实验室动物检测的更换、减少和改进，即3R战略。欧洲第2010/63/EU号指令（自2013/01/01月起生效）也加强了对疫苗制造商和实验室参与狂犬病疫苗质量控制以及狂犬病研究^的限制。因此，开发、验证和使用替代体外方法现已成为优先事项。这些不仅在道德上是健全的，而且还可以减少批次测试成本，并将结果的时间缩短到数小时，而不是第³周。

在RABV粒子的表面，糖蛋白采用^{12、13、14、15、1613,14,15,16}的三角状。¹²在狂犬病疫苗中，这种原生三分体构成诱导VNAbs¹⁷的主要免疫原，而单体、可溶性或变性糖蛋白的免疫原性差^{18、19。,19}因此，沿疫苗生产过程中保存糖蛋白的修剪器是保存最佳免疫原性潜力的良好指标。几种免疫化学方法，如抗体结合测试^{20、21、,21}单径向免疫扩散（SRD）测试²²和ELISA测试23、24、25、26、27，均被世卫组织技术报告系列^{23,24,25,26,272}和欧洲专著³推荐，以量化狂犬病疫苗中的抗原含量。制造商使用这些来监测疫苗生产的一致性，并由OMCL评估人类疫苗^的批次28的一致性配方，即使NIH测试仍考虑其效力。

然而，所有这些免疫化学方法并不等效。SRD测试需要预先处理，可能会改变膜锚定修剪器，并导致糖蛋白^22，29,29的可溶性或变性形式。因此，SRD在区分免疫原性和非免疫原性糖蛋白方面效率不高，导致对疫苗批次的免疫原性评价不完善。相比之下，ELISA测试更敏感^22，保留了糖蛋白的原生结构，更适合确定糖蛋白的原生折叠修剪器的含量。ELISA 测试可以使用兔子多克隆或小鼠单克隆抗糖蛋白抗体纯化和浓缩与硫酸铵。研究表明，NIH测试与ELISA在疫苗中评估的抗原含量良好一致，并得出结论，ELISA方法适用于体外效力测试。这主张ELISA测试至少可以补充甚至取代NIH测试⁴4，26，27，30，31，32，33。^{,26,27,30,31,32,33}今天，欧洲药典建议使用经过验证的血清学或免疫化学测定作为NIH测试³的替代品。完全避免动物使用疫苗效力已成为一个现实的观点。

下面介绍的方法是基于一个间接的ELISA三明治免疫捕获使用小鼠单克隆抗体克隆（mAb-D1），识别的抗原位点III（a330至338）的三角RABV糖蛋白^{15，34。15,}该方法最初是在巴斯德研究所^26、30,30中开发，然后由国家国家麻醉研究所（ANSM）实验室（即法国OMCL^4,4，33）进行优化和验证。mAb-D1 既用于使板敏感，又用于检测捕获的抗原。这允许对糖蛋白修剪器进行特定定量，即免疫原性RABV抗原。用于检测的 mAb-D1 标有过氧化物酶，在基材和色蛋白存在时会显示此特性。对经测试的疫苗和参考疫苗的吸收度进行比较，可以确定免疫原糖蛋白含量。值得注意的是，同一类型的测定可以适用于不同的mAbs识别不同的抗原位点的RABV糖蛋白^35。与硫酸铵抗糖蛋白多克隆兔免疫球蛋白G（IgG）或单克隆小鼠球蛋白一起获得和纯化或浓缩的方法，在³⁶之前与过氧化物酶³⁷结合抗体的方法中得到了广泛的描述。