Her beskriver vi en indirekte ELISA sandwich immunfangst til bestemmelse af det immunogene glycoprotein indhold i rabiesvacciner. Denne test bruger en neutraliserende Monoklonal Antistof (mAb-D1) genkende glycoprotein trimers. Det er et alternativ til in vivo NIH-testen for at følge konsistensen af vaccinestyrken under produktionen.
Den voksende globale bekymring for dyrevelfærden tilskynder fabrikanter og de nationale kontrollaboratorier til at følge 3Rs-strategien for erstatning, reduktion og forbedring af laboratoriedyreforsøg. Det anbefales at udvikle in vitro-tilgange på WHO-plan og på europæisk plan som alternativer til NIH-testen til vurdering af rabiesvaccinestyrken. På overfladen af rabiesvirus (RABV) partikel, trimningaf glycoprotein udgør den største immunogen til at fremkalde Viral Neutraliserende Antistoffer (VNAbs). En ELISA-test, hvor neutraliserende monoklonale antistoffer (mAb-D1) genkender glycoproteinets trimeriske form, er blevet udviklet til at bestemme indholdet af det oprindelige foldede trimeric glycoprotein sammen med produktionen af vaccinebatcherne. Denne in vitro-styrketest viste en god overensstemmelse med NIH-testen og er fundet egnet i kollaborative forsøg udført af RABV-vaccineproducenter og OMCL’er. Undgåelse af anvendelse af dyr er et opnåeligt mål i den nærmeste fremtid.
Den præsenterede metode er baseret på en indirekte ELISA-sandwichimmunfangst ved hjælp af mAb-D1, som genkender de antigene steder III (aa 330 til 338) af det trimeriske RABV glycoprotein, dvs. mAb-D1 anvendes til både overfladebehandling og påvisning af glycoproteintrimere, der findes i vaccinebatchen. Da epitop er anerkendt på grund af dens konformationelle egenskaber, den potentielt denatureret glycoprotein (mindre immunogenic) kan ikke tilfangetages og detekteres af mAb-D1. Den vaccine, der skal testes, inkuberes i en plade, der er sensibiliseret med mAb-D1. Bundne trimeric RABV glycoproteiner identificeres ved at tilføje mAb-D1 igen, mærket med peroxidase og derefter afsløret i nærvær af substrat og kromogen. Sammenligning af den målte absorbans for den testede vaccine og referencevaccinen gør det muligt at bestemme indholdet af immunogene glycoprotein.
Siden mere end 50 år, nih test1 bruges som en guld standard metode til at vurdere rabies vaccine potens før batch frigivelse. Denne test består af en intraperitoneal immunisering af grupper af mus med den vaccine, der skal testes efterfulgt af en intracerebral (IC) udfordring 14 dage senere med Challenge Virus Standard (CVS) stamme af rabiesvirus (RABV). Styrken vurderes ud fra andelen af mus, der overlever IC-udfordringen. Selv om WHO2 og European Pharmacopeia3 stadig kræver NIH-testen til vurdering af vaccinens styrke, lider denne test under flere forhindringer: resultaterne er meget variable4; infektiøs RABV anvendes under udfordringen, og dette kræver både tekniske færdigheder og strenge biosikkerhedsforanstaltninger; der anvendes et stort antal dyr, og udfordringens alvor giver anledning til alvorlige etiske betænkeligheder5. En mindre alvorlig variation af denne test er blevet udviklet: to uger efter intra-peritoneal immunisering, mus er ikke udfordret af IC, men blødte og testet for tilstedeværelsen af specifikke RABV neutraliserende antistoffer (VNAbs) i deres serum ved hjælp af en in vitro-neutralisering test. Denne test kræver dog stadig at ofre et stort antal laboratoriemus, selv om den allerede er i brug for veterinærvaccinerne6,7 og er blevet overvejet til humane vacciner8.
Fra nu af opfordrer både internationale9 og europæiske10-anbefalinger fabrikanter og nationale kontrollaboratorier (officielle lægemiddelkontrollaboratorier – OMCL’er) til at gennemføre erstatning, reduktion og forbedring af laboratoriedyreforsøg, der kaldes 3Rs-strategien. Det europæiske direktiv 2010/63/EU (gældende siden 2013/01/01) vedrørende beskyttelse og velfærd for dyr har også skærpet begrænsningerne for vaccineproducenter og -laboratorier, der er involveret i kvalitetskontrol af rabiesvacciner samt rabiesforskning11. Som følge heraf er udvikling, validering og anvendelse af alternative in vitro-tilgange nu blevet en prioritet. Disse er ikke kun etisk forsvarlige, men kan også reducere batchtestomkostningerne og forkorte tiden for resultater til timer i stedet for uge3.
På overfladen af RABV-partiklen, glycoprotein vedtager en trimeric form12,13,14,15,16. I rabiesvaccine udgør denne oprindelige trimeriske form den vigtigste immunogeninducerende VNAbs17, mens monomeriske, opløselige eller denaturerede glycoproteiner er dårligt immunogene18,19. Således er bevarelsen af glycoproteinafet langs vaccineproduktionsprocessen en god indikator for bevarelsen af et optimalt immungent potentiale. Flere immunokemiske metoder, såsom antistofbindingstest20,21, enkeltradial immundiffusion (SRD) test22 og ELISA-test23,,24,,25,26,27, anbefales af WHO’s tekniske rapport serie2 og den europæiske monografi3 for at kvantificere antigenindholdet i rabiesvacciner. Disse anvendes af producenterne til at overvåge sammenhængen i vaccineproduktionen og af OMCL til at vurdere den konsekvente formulering af partier af humane vacciner28, selv om NIH-testen stadig tages i betragtning til styrken.
Men alle disse immunokemiske metoder er ikke ækvivalente. SRD-testen kræver en forbehandling , som kan ændre de membranforankrede trimler og resultere i en opløselig eller denatureret form af glycoprotein22,29. Derfor er SRD ikke meget effektiv til at diskriminere mellem immungene og ikke-immungene glycoproteiner, hvilket resulterer i en ufuldstændig vurdering af immunogeniciteten af et vaccineparti. I modsætning hertil er ELISA-testen mere følsom22, bevarer glycoproteinets oprindelige struktur og er mere hensigtsmæssigt at bestemme indholdet af de oprindeligt foldede trimmere af glycoprotein. ELISA-testen kan anvende enten kaninpolyklonale eller mus monoklonale anti-glycoprotein antistoffer renset eller koncentreret med ammoniumsulfat. Undersøgelser har vist god overensstemmelse mellem NIH-testen og det antigenindhold, som ELISA har evalueret i vacciner, og konkluderet, at ELISA-metoder er egnede til in vitro-styrketesten. Dette slår til lyd for , at ELISA-test i det mindste kan supplere eller endog erstatte NIH-test4,26,27,30,31,32,33. I dag anbefaler Den Europæiske Farmakopé, at der anvendes validerede serologiske eller immunokemiske analyser som alternativer til NIH-test3. Den fuldstændige undgåelse af dyrs anvendelse til vaccinepotens er blevet et realistisk perspektiv.
Metoden nedenfor er baseret på en indirekte ELISA-sandwichimmunfangst ved hjælp af en monoklonal antistofkloning af mus (mAb-D1 ), som genkender de antigene steder III (aa 330 til 338) af det trimeriske RABV glycoprotein15,34. Denne metode blev oprindeligt udviklet på Institut Pasteur26,30 ogderefter optimeret og valideret af Agence Nationale de Sécurité du Médicament et des produits de santé (ANSM) laboratoriet,dvs.4, MAb-D1 anvendes både til sensibilisering af pladen og efterfølgende til detektering af det tilfangetagne antigen. Dette giver mulighed for specifik kvantificering af glycoproteintrimere, dvs. Den mAb-D1, der anvendes til påvisning, er mærket med peroxidase, som afsløres ved tilstedeværelse af substrat og kromogen. Sammenligning af den målte absorbans for den testede vaccine og referencevaccinen gør det muligt at bestemme indholdet af immunogene glycoprotein. Det skal bemærkes, at den samme type analyse kan anvendes til forskellige mAbs, der genkender forskellige antigene steder af RABV glycoprotein35. Metoden til at opnå og rense eller koncentrere sig med ammoniumsulfat anti-glycoprotein polyklonale kanin immunglobuliner G (IgG) eller monoklonale mus globuliner er blevet udførligt beskrevet tidligere36 sammen med metoden til at konjugere antistoffer med peroxidase37.
Den epitop, der genkendes af mAb-D1, er placeret på det antigene sted III i RABV glycoprotein, som ikke kun er immunodominerende for induktion af VNAbs, men også involveret i neurovirulence, patogenicitet40,41 og receptorgenkendelse42. Der er en anden vigtig antigen site langs glycoprotein, site II43, mod hvilken flere MAbs er blevet isoleret såsom mAb-WI-111235. Disse kan også bruges i d…
The authors have nothing to disclose.
Dr. Sylvie Morgeaux og Dr. Jean-Michel Chapsal skal anerkendes for deres centrale deltagelse for at etablere ELISA-analysen om vaccinepartier og for at organisere internationale workshops og samarbejdsstudier. Vi takker Sabrina Kali for kritisk læsning af manuskriptet. Dr. Pierre Perrin var ansvarlig for isolering og karakterisering af mAb-D1. Dette arbejde er hovedsagelig blevet støttet af Institut Pasteur finansiering.
Class II Biological Safety Cabinet | ThermoFisher Scientific | 10445753 | if titrating live virus |
Clear Flat-Bottom Immuno Nonsterile 96-Well Plates, 400 µL, MAXISORP | ThermoFisher Scientific | 439454 | good for binding to the loaded antibody |
Equip Labo Polypropylene Laboratory Fume Hood | ThermoFisher Scientific | 12576606 | for the preparation of sulfuric acid |
Immunology Plate Strong Adsorption MAXISORP Flat Bottom Well F96 |
Dutscher | 55303 | good for binding to the loaded antibody |
Microplate Sealing Tape(100 sheets) | ThermoFisher Scientific | 15036 | |
Microplate single mode reader Sunrise | TECAN | ||
Microplate shaker-incubator | Dutscher | 441504 | |
Microplate washer Wellwash | ThermoFisher Scientific | 5165000 | |
Multichannel pipette (30-300 µL) 12 channels | ThermoFisher Scientific | 4661180N | |
Single Channel pipettes (Kit 2 : Finnpipettes F2 0.2-2 μL micro, 2-20 μL, 20-200 μL & 100-1000 μL) | ThermoFisher Scientific | 4700880 |